肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,对人类健康与生命造成严重威胁[1]。近年来,随着我国工业化程度加快以及环境污染加剧,我国肺癌发病和死亡率逐年上升。目前肺癌传统治疗效果欠佳,肺癌患者5年生存率仅为16%[2],急需寻找有效的治疗方法。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度大于200 nt、无蛋白质编码功能、缺少开放阅读框(open reading frame,ORF)的功能性RNA分子,可在染色体构象、转录和转录后等水平发挥重要的调控作用,在肿瘤的各个发展阶段都发挥着重要的作用[3],针对lncRNA的精准调控为肺癌寻找治疗靶点提供了新的思路。转移抑制性长 链非编码RNA(lncRNA inhibiting metastasis,lncRNA LIMT),又名LINC01089,定位于12号染色体上,包含有7个外显子序列,其在乳腺癌中首次被发现,在乳腺癌组织中表达下调并且与不良预后呈正相关,但其在肺癌中的作用尚不得而知[4]。转化生长因子β(transfoming growth factor-β,TGF-β)信号通路在调节组织和器官稳态所必需的不同细胞过程中发挥相关作用,近年来研究发现其参与多种癌症形成的过程[5]。目前对lncRNA LIMT的研究较少,本研究通过RT-qPCR检测肺癌组织中lncRNA LIMT的表达,并分析lncRNA LIMT在肺癌细胞增殖及凋亡中的作用及其与TGF-β信号通路的关系,对揭秘肺癌发生发展的分子机制及研发新的治疗药物提供新的思路。

1、材料与方法

1.1试验材料

收集2017年3月至2018年9月在本院行肺癌切除术的患者的癌组织及对应癌旁组织(距离肿瘤边缘>5 cm),癌组织经我院病理科证实为肺癌肿瘤组织,癌旁组织证实为无肿瘤细胞,选取符合标准的45例肺癌组织及癌旁组织进行实验研究。患者术前未行放疗、化疗及其他辅助治疗,所有组织在采集之前均已取得患者的知情同意,本研究已获得本院医学伦理委员会批准。

人肺癌细胞系A549购于中国科学院上海细胞库,使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养。待细胞生长至密度大于80%时进行传代培养。

1.2实验方法

1.2.1细胞转染

lncRNA LIMT过表达质粒pEGFP-C1-LIMT及空载质粒,敲减lncRNA LIMT的特异性siRNA-LIMT及对照siRNA-NC均购买于GenScript公司。将细胞接种于6孔板上,待细胞密度达到70%～80%时,按照LipofectamineTM 2000试剂盒说明书提供的方法进行转染。使用500μl RPMI 1640培养液稀释4μg过表达质粒及其空载质粒,500μl RPMI 1640培养液稀释50 nmol/L siRNA-LIMT及siRNA-NC,500μl RPMI 1640培养液稀释5μl LipofectamineTM 2000试剂,将质粒稀释液及LipofectamineTM 2000稀释液轻轻混匀,室温下静置20 min;吸出6孔板中的培养液,每孔加入1 ml转染混合液,轻轻混匀,放回孵育箱中继续培养;转染48 h后,向细胞培养基中加入G418进行筛选,G418筛选2周左右,提取细胞总RNA进行RT-qPCR,检测转染效率。

1.2.2总RNA的提取及荧光定量PCR

组织及细胞样本经液氮研磨,使用TRIzol裂解液提取总RNA,Nano drop 2000检测总RNA浓度及纯度,光密度(OD)260/280在1.8～2.0之间表示总RNA质量良好。使用RNA逆转录试剂盒将所提取的总RNA反转录为cDNA,使用Exicycler TM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。lncRNA LIMT及内参基因β-actin引物通过Primer5.0设计,生工生物工程有限公司 合成,lncRNA LIMT上游引物为5'-TTACCCACCCTACTTTCCC-3',下游引物为5'-TTGTGCTCCAGCCTTCC-3';β-actin上游引物为5'-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3',下游引物 为5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。反应体系为:cDNA 1μl,上下游引物(10μmol/L)各0.5μl,SYBR GREEN mastermix×10μl,加ddH2O补足至20μl。 反应条件为:50℃2 min;95℃10 min;95℃15 s,60℃15 s,40次循环;95℃15 s。采用公式2-ΔΔCT定量分析lncRNA LIMT的表达,△Ct =Ct目的基因-Ct内参,△△Ct =△Ct处理组-△Ct对照组。

1.2.3细胞增殖能力检测

使用胰蛋白酶消化细胞,将细胞重悬于1 ml细胞培养基,吸10μl细胞悬液,加入计数板进行计数,调整细胞为2×104个/ml,将细胞悬液以100μl/孔加入96孔板中,置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养,分别在培养0 h、24 h、48 h、72 h后向每孔加入10μl CCK-8试剂,孵育箱内孵育2 h后,使用酶标仪在450 nm处检测OD值,以时间为横坐标,OD450为纵坐标,绘制细胞的生长曲线。

1.2.4细胞凋亡能力检测

使用胰蛋白酶消化细胞,细胞消化后以1 000 r/min离心5 min,PBS洗涤后再离心一次,将细胞重悬于100μl 1×Binding buffer,细胞计数板计数,调整细胞密度为1×106个细胞/ml,取100μl细 胞悬液吸取到1.5 ml EP管中,加入5μl FITC Annexin V染料和5μl PI染料,轻轻旋涡细胞,在室温下避光孵育15 min,每个EP管中加入400μl 1×Binding buffer,1 h内使用流式细胞仪上机 检测。

1.2.5蛋白印迹实验

收集处于对数生长期的各转染组细胞,RIPA总蛋白裂解液裂解细胞,提取总蛋白,BCA检测试剂盒测定总蛋白浓度。总蛋白经10%分离胶的琼脂糖凝胶电泳进行分离;蛋白分离后转移至PVDF膜上,100 V恒压转膜100 min;转膜后5%脱脂牛奶室温封闭1 h,1×PBST洗膜5 min;TGF-β1抗体和Smad4抗体使用1×PBST按1∶2 000进行稀释,GAPDH抗体按1∶1 000稀释,加入一抗稀释液进行孵育,4℃摇床上过夜;1×PBST洗膜3次,每次10 min;加入二抗稀释液进行孵育,室温摇床上孵育1 h;1×PBST洗膜3次,每次10 min。向膜上滴加适量曝光液,Las-4000成像系统下曝光显影,保存图像,并使用Image Lab 4.0软件分析目的蛋白表达水平。

1.3统计学方法

使用统计学软件IBM SPSS 23.0 software对数据进行分析,数据结果表示为均值±标准差,配对t检验分析人肺癌组织及配对癌旁组织中lncRNA LIMT的表达差异,独立样本t检验分析各处理组之间的统计学差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 lncRNA LIMT在人肺癌组织及配对癌旁组织中的表达情况

采用RT-qPCR实验检测45对人肺癌组织及配对癌旁组织中lncRNA LIMT的表达情况,结果显示,与配对癌旁组织相比,lncRNA LIMT在人肺癌组织中的表达水平降低(图1,P<0.05),表明lncRNA LIMT在人肺癌组织中异常低表达。

图1 lncRNA LIMT在人肺癌组织及配对癌旁组织中的表达情况

2.2肺癌细胞中lncRNA LIMT的过表达及敲减水平验证

通过RT-qPCR实验验证肺癌细胞中lncRNA LIMT的过表达及敲减水平,结果显示,转染pEGFP-C1-LIMT质粒的肺癌细胞中lncRNA LIMT的表达水平显著高于转染空载质粒(图2A,P<0.001),表明肺癌细胞成功过 表达lncRNA LIMT;相反,转染siRNA-LIMT的肺癌细胞中lncRNA LIMT的表达水平显著低于转染siRNA-NC(图2B,P<0.01),表明肺癌细胞中lncRNA LIMT成功敲减。由此可见,转染成功,可用于后续实验。

2.3 lncRNA LIMT对肺癌细胞增殖的影响

通过CCK-8实验分析了lncRNA LIMT对肺癌细胞增殖的影响,结果显示,过表达lncRNA LIMT的肺癌细胞的增殖能力明显 低于对照组(图3A,P<0.01);相反,敲减lncRNA LIMT的肺癌细胞,其增殖能力明显高于对照组(图3B,P<0.001)。由此可见,lncRNA LIMT在肺癌细胞中发挥抑制细胞增殖的作用。

图2肺癌细胞中lncRNA LIMT的过表达(A)及敲减(B)水平验证

图3 lncRNA LIMT表达对肺癌细胞增殖能力的影响

2.4 lncRNA LIMT对肺癌细胞凋亡的影响

通过流式细胞术研究了lncRNA LIMT对肺癌细胞凋亡的影响,结果显示,过表达lncRNA LIMT的肺癌细胞凋亡率显著高于对照组(图4A,P<0.01);相反,敲减lncRNA LIMT的肺癌细胞凋亡率显著低于对照组(图4B,P<0.01)。由此可见,lncRNA LIMT在肺癌细胞中发挥促进细胞凋亡的作用。

图4 lncRNA LIMT过表达(A)及敲减(B)对肺癌细胞凋亡能力的影响

2.5 lncRNA LIMT对TGF-β信号通路的影响

利用Western blotting检测过表达及敲减lncRNA LIMT对TGF-β信号通路中相关蛋白TGF-β1及Samd4表达水平的影响,结果显示,lncRNA LIMT过表达的肺癌细胞中TGF-β1蛋白的相对表达量显著低于对照组,Samd4蛋白的表达量显著高于对照组(图5A,P<0.05);相反,敲减lncRNA LIMT的肺癌细胞中TGF-β1蛋白的相对表达量显著高于对照组,Samd4蛋白 的表达量显著低 于对照组(图5B,P<0.05)。

图5 lncRNA LIMT过表达(A)及敲减(B)在蛋白水平对TGF-β信号通路中相关蛋白的调控

3、讨论

近年来,肺癌在早期发现、早期诊断和多学科综合治疗方面取得了较大进展,但是我国肺癌的发病率和死亡率仍逐年上升[6]。目前,分子生物靶向治疗由于特异性高、损伤小、毒副反应小等特点,备受科研 人员和临床工作者的青 睐。lncRNA作为一种参与癌症发生、发展的生物学遗传分子,在近几年来逐渐受到重视并在科研中崭露头角[7]。因此,为寻找潜在的肿瘤标志物和新的治疗策略,深入探究lncRNA在肺癌发生发展中的作用及具体分子机制显得至关重要。

lncRNA起初由于不具备编码蛋白的功能而被认为是存在于人类基因组中的“噪音”[8]。随着全基因测序技术突飞猛进的发展,越来越多的研究表明,lncRNA与人类正常的发育过程、生理活动以及某些疾病的产生等密切相关。随着研究的深入,PVT1、RMRP、HOTAIR等多种lncRNA在肺癌中的作用及功能被报道[9,10,11]。lncRNA LIMT是近年来新发现的一个lncRNA,在乳腺癌中具有抑制转移作用[12]。Sas-Chen等[4]研究发现,以EGF刺激下的正常乳腺上皮细胞MCF-10A为乳腺癌发生模型,通过基因芯片和生物信息学分析发现在EGF刺激之后,LINC01089在MCF-10A中表达下调。梁运田等[13]研究发现,lncRNA LIMT在肝细胞肝癌组织中呈现低表达,与分化程度呈正相关,提示lncRNA LIMT在肝细胞肝癌发生发展中发挥作用。本研究采用RT-qPCR测定45对肺癌组织及癌旁组织中lncRNA LIMT的表达差异,结果发现肺癌组织中lncRNA LIMT的表达下调,提示lncRNA LIMT可能扮演着“抑癌基因”的角色而在肺癌中发挥作用。lncRNA LIMT很有可能是一种新的预测肺癌患者预后的分子标志物。

几乎所有的肿瘤都有一个明显的特征,即细胞不受控制的生长及细胞凋亡受抑,导致肿瘤细胞的永生化。lncRNA LIMT在调控细胞增殖、凋亡、转移等生物学功能中发挥重要作用。Sas-Chen等[4]研究发现,lncRNA LIMT能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231以及在EGF刺激下的MCF-10A细胞的运动能力。袁洪范等[14]研究发现,过表达lncRNA LIMT的乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到显著抑制,同时促进乳腺癌细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期。Zeng等[15]研究发现,lncRNA LIMT过表达能够有效抑制上皮卵巢肿瘤的生长。本研究进一步对lncRNA LIMT的功能进行验证,从细胞学水平探讨lncRNA LIMT对肺癌细胞增殖与凋亡的影响,结果发现,lncRNA LIMT过表达显著抑制了肺癌细胞的增殖,同时促进了细胞的凋亡;相反,lncRNA LIMT敲减显著促进了肺癌细胞的增殖,同时抑制了细胞的凋亡。本研究进一步证实了lncRNA LIMT在肺癌中发挥抑癌作用,对lncRNA LIMT表达水平进行精准调控无疑是肺癌治疗中一个新的治疗策略。

TGF-β信号通路在调节组织和器官稳态所必需的不同细胞过程中发挥相关作用,并且在细胞的增殖、分化、表型转化及肿瘤发生中发挥重要作用。TGF-β可与I型(TβRI)和Ⅱ型受体(TβRⅡ)结合,从而将细胞外信号转入细胞内,在细胞内活化Smad2和Smad3,活化的Smad2、Smad3与Smad4结合形成一个寡聚复合物,Smad复合物可以易位到细胞核并作为转录因子调节特定的基因转录反应,进而调控肿瘤细胞的生物学功能[16,17]。TGF-β1在TGF超家族中属于最经典的转化生长因子[18],Smad4在TGF-β信号通路中处于核心地位,若Smad4表达失调整个TGF-β信号转导将会中断[19]。本研究通过Western blotting检测过表达及敲减lncRNA LIMT对TGF-β信号通路中相关蛋白TGF-β1及Samd4表达水平的影响,结果发现,lncRNA LIMT过表达可显著抑制TGF-β1蛋白的表达,促进Samd4蛋白 的表达,而敲减lncRNA LIMT的结果与之相反。由此可见,lncRNA LIMT在肺癌细胞中抑制TGF-β信号通路转导,这可能是lncRNA LIMT抑制肺癌细胞增殖、诱导凋亡的分子调控机制之一。然而,对于lncRNA LIMT通过TGF-β信号通路调控肺癌细胞增殖及凋亡的具体机制仍需进一步研究。

综上所述,lncRNA LIMT在肺癌组织中表达下调,过表达lncRNA LIMT抑制肺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,敲减lncRNA LIMT促进肺癌细胞增殖,抑制细胞凋亡,可能通过对TGF-β信号通路的调控来实现。

参考文献：

[13]梁运田.长链非编码RNA LIMT在肝细胞肝癌TGF-β1信号通路及上皮-间质转化中的作用研究[D].郑州:郑州大学,2019.

[14]袁洪范.长链非编码RNA LINC01089通过Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌的功能及机制研究[D].重庆:重庆医科大学,2019.

王春刚,陈山,王志峰,颜洪顺,陆小珠.长链非编码RNA LIMT调控TGF-β信号通路对肺癌细胞增殖与凋亡的影响[J].现代肿瘤医学,2020,28(18):3108-3113.

基金:国家自然科学基金资助项目(编号:8326163207);海南省自然科学资助项目(编号:H20185064268)