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基于微通道的肿瘤标志物磁性SERS传感器制备

2025-06-16 33 上传者：管理员

摘要：提出了一种在微通道内快速、低成本开展磁性表面增强拉曼散射(SERS)检测传感器的制备方法。外部磁力作用下，SERS探针之间、SERS探针与磁性捕获基底之间形成更多的SERS活性热点，对肝癌标志物甲胎蛋白(AFP)的定量检出限低至0.1 ng/mL,具有很好的检测灵敏度、重复性、选择性和良好的线性关系。与大体积的芯片外制备方法相比，微通道内磁性免疫传感器的制备可以节省试剂耗量、反应时间短、节约成本和时间，为SERS技术在肿瘤标志物检测领域的应用提供了良好的技术支撑。

关键词：
SERS
微流控芯片
磁性捕获基底
肿瘤标记物
表面增强拉曼光谱
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肿瘤标记物的检测是早期肿瘤诊断最常用的技术[1,2]｡当前关于肿瘤标记物的检测虽然在早期癌症诊断的研究上取得了重要进展[3~5],但仍存在检测设计和应用灵敏度不佳､灵活性不够,不能提供宽线性范围宽的定量数据等缺陷｡而表面增强拉曼散射(surfaceenhancementRamanspectroscopy,SERS)技术能够在生物传感中提供丰富的指纹信息,检测快速､低成本且对生物样本无损伤,已成为近年来极有吸引力的一种肿瘤标志物检测方法[6~10]｡在肿瘤标记物SERS免疫分析结构中,“抗体—抗原SERS探针”的夹心检测结构是最典型的一种[11]｡SERS探针由内到外依次为:金纳米颗粒(Aunanoparticles,AuNPs)作为拉曼增强介质[12],具有明显拉曼信号的拉曼分子,以及可特异性捕获目标抗原的抗体｡SERS信号的强度取决于被吸附的SERS探针的数量,而这又取决于被吸附的抗原的数量｡因此,可以利用夹层SERS结构间接检测到抗原的浓度并进行定量分析｡然而,SERS探针之间很难非常接近,导致SERS活性“热点”数量较少,检测灵敏度较低｡同时,由于需要抗原—抗体的多重反应､试剂消耗高､成本高､反应时间长､实验条件可控性差､实验结果稳定性差等[13,14]｡基于微流控芯片平台的小型化､高效､快速､便携性､成本低､试剂和样品消耗量低等优点[15],有望解决SERS免疫检测领域的上述不足[16,17]｡

本文提出了一种基于微流控芯片的超灵敏､快速､低成本､可控的双增强磁性SERS免疫传感器制备方法｡在微流控芯片上,通过设计2个分支分别生成磁性捕获基底和SERS免疫探针,再依次将SERS磁性捕获基底､肿瘤标记物､SERS免疫探针顺序可控地在通道内混合,形成可控的SERS免疫传感器结构,实现快速､低成本､高灵敏度及高可控性SERS免疫传感器的制备,为SERS免疫分析技术在临床诊断中的推广应用提供良好的技术支撑｡

1、实验

1.1试剂与耗材

四乙基正硅酸酯(tetraethylorthosilicate,TEOS)､4—巯基苯甲酸(4—mercaptobenzoicacid,4—MBA)､四水合氯金酸(HAuCl4·4H2O､AR)､聚二甲基二烯丙基氯化铵(polydimethyldiallylammoniumchloride,PDDA)均购自国药化学试剂有限公司,聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)购买自Sigma-Aldrich,甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)抗原､抗体购自上海谷晨生物技术有限公司｡其他均购自重庆川东化学集团｡

1.2SERS免疫传感器的设计

本文的SERS免疫传感器由SERS免疫探针､AFP抗原和磁捕获底物3部分组成｡

SERS免疫探针由AuNPs､拉曼标记分子和抗体组成｡利用AuNPs的电磁增强效应放大拉曼标记分子4—MBA的拉曼信号｡通过Au-S键将4—MBA修饰在AuNPs表面,进一步利用抗体的氨基与4—MBA的羧基之间的脱水缩合反应修饰抗体,形成SERS免疫探针,示意如图1所示｡

图1SERS免疫探针结构示意

磁性捕获基底由磁性纳米颗粒四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4nanoparticles,Fe3O4NPs)､SiO2､AuNPs､抗体组成｡SiO2壳包裹Fe3O4NPs后,再借助阳离子聚合物PDDA将带负电荷的AuNPs修饰在表面,再用PDDA将带负电荷的抗体修饰到磁性颗粒的外部,形成完整的磁性捕获基底｡

实际检测时,磁性捕获基底最外层的抗体可特异性识别目标肿瘤标志物,进一步特异性吸附SERS免疫探针(如图2所示),外部施加磁场力时,磁性免疫传感结构之间十分靠近,SERS免疫探针之间､SERS免疫探针与磁性捕获基底之间形成诸多的SERS活性热点,双增强SERS效应的基础上,实现肿瘤标志物的高灵敏度SERS检测｡

图2三明治磁性SERS传感器结构示意

1.3制备和SERS检测

1.3.1微流控芯片的制备

芯片的整体结构如图3所示｡总长度设计为9cm,宽度为3cm,4个混合反应区均设置为蛇形通道,长､宽和高分别为3cm,200μm和100μm｡采用标准光刻技术和湿法蚀刻技术制备了带有微通道的玻璃基底｡将PDMS预聚物和固化剂以10:1的比例混合､排气后,倒在干净光滑的玻璃板上,在90℃下固化2h｡然后在制备好的PDMS盖片上对应芯片的进出口进行穿孔,方便进排液｡玻璃基底､PDMS盖片分别用去离子水和乙醇各超声清洗5min,用氮气干燥｡再用氧离子对PDMS盖片激活30s,通过手工将PDMS盖片与玻璃基底进行对准,用力按压进行键合组装｡

图3微流控芯片的设计文章来源:

1.3.2Au@4—MBA的制备

利用常规的Frens法[18,19]制备AuNPs,然后将制备的Au溶胶和10-2mol/L4—MBA溶液分别以1:1,10:1,25:1和30:1的体积比反应｡分别在1,10,20,30min后,将混合溶液以8000r/min离心3min,弃上清液,加入PBS,4℃冰箱冷藏备用｡

1.3.3Fe3O4@SiO2@Au的制备

Fe3O4NPs可用作磁性捕获材料[20]｡将2.7gFeCl3·6H2O在80mL乙二醇中快速搅拌0.5h,然后依次加入7.2g乙酸钠和2g聚乙二醇,连续搅拌0.5h,200℃加热16h｡反应结束后,将溶液冷却至室温,并倒入离心管中｡用磁铁吸附Fe3O4NPs,弃用上清液[20]｡然后用乙醇和去离子水洗涤多次,最后通过超声波溶解在去离子水中｡将50mLFe3O4NPs溶液分散在25mL乙醇和5mL去离子水的混合溶液中｡然后连续搅拌,加入400μL28%氨水｡搅匀后,加入250μLTEOS,再搅拌6h后,用磁分离清洗,弃上清液后,加入10mL2%的PDDA溶液混合10min,接着加入10mLAu溶胶反应1h,磁分离去上清液,再加入10mL2%的PDDA溶液,常温下混合10min,磁分离清洗去上清液后冷藏备用｡

1.3.4微通道内SERS免疫传感器的制备及SERS检测

首先将1.3.3节制备的Fe3O4@SiO2@Au注入入口1,将AFP抗体注入入口2,入口4和入口5分别注入Au@4—MBA和AFP抗体,出口施加负压,流速设置为0.15μL/min,充分混合后,分别得到Fe3O4@SiO2@Au@抗体和Au@4—MBA@抗体,接着将AFP注入入口3,Fe3O4@SiO2@Au@抗体与AFP进一步在混合反应区3进行充分反应,实现AFP在磁性捕获基底表面的捕获[21]｡入口4通入1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液,实现对SERS免疫探针表面未修饰抗体位点的封闭｡2个分支最终在混合反应区4进行充分混合,在检测区微通道底部施加外部磁力,最终形成的磁性SERS免疫传感结构在此区域汇聚,进一步利用拉曼光谱仪对此区域的样品进行SERS测试｡

1.4表征

用岛津紫外UV—2450紫外—可见分光光度计表征Au@4—MBA的吸收光谱｡利用场发射扫描电镜(fieldemissionSEM,FESEM)对金纳米颗粒的结构和粒径进行了表征｡拉曼光谱采集采用FinderVista共聚焦显微拉曼光谱仪,以氦氖633nm激光器为激发源,所有的SERS图谱采集积分时间均为1s｡

2、结果与讨论

2.1SERS探针制备条件的优化

本文提出的SERS免疫传感器受到吸附在Au表面的4—MBA分子数的影响｡首先,将Au溶胶和10-2mol/L4—MBA溶液在不同体积比下混合20min,制备了一系列Au@4—MBA样品｡紫外—可见吸收光谱如图4所示｡结果发现,随着体积比的增加,AuNPs和4—MBA的吸收峰强度逐渐增加且在25:1时达到稳定,此时Au表面吸附的4—MBA分子数达到饱和｡

图4将Au溶胶和10-2mol/L4—MBA在不同体积比下混合20min的紫外—可见吸收光谱

此外,当体积比为25::1时,分别在不同的混合时间下制备了Au@4—MBA,测得的紫外—可见吸收光谱如图5所示｡发现随着反应时间的延长,吸附的4—MBA溶液的吸收峰强度增加,最终在20min时达到稳定,表明此时被吸附的4—MBA分子数达到饱和｡

2.2肝癌标志物AFP的灵敏度和定量检测

AFP是肝癌的重要蛋白标志物｡其在人体液中的浓度通常小于25ng/mL[22]｡患肝癌[23]时应大于400ng/mL｡对其检测需具有高灵敏度､可重复性和特异性良好的检测技术｡灵敏度测试结果如图6(a)所示｡结果发现,当三明治型磁性SERS免疫传感器形成时,4—MBA的拉曼信号会增强｡并且在1098cm-1､1597cm-12个拉曼位移处,有2个尖锐的特征峰,属于v(C—C)苯环呼吸模式[24]｡本文选择了1597cm-1的信号强度作为定量分析标准｡图6(b)描述了AFP浓度与归一化拉曼强度之间的线性关系,获得的标准曲线显示,在10-6~10-10g/mL之间具有良好的线性范围,相关系数(R2)为0.9943｡检测限(limitofdetection,LOD)计算为10-10g/mL,低于健康人和肺癌患者的正常浓度｡这一现象表明,该SERS传感器在快速､灵敏地检测临床样本中的肿瘤生物标志物方面具有广阔的应用前景｡

图5将Au溶胶和10-2mol/L4—MBA以25:1的体积比混合不同时间,得到的Au@4—MBA的紫外—可见吸收光谱

图6测试结果

2.3微通道中磁性SERS传感器的检测可重复性评价

可重复性是评价SERS检测结果的重要指标｡在相同的激光功率和测试条件下,对10-6g/mLAFP制备的免疫传感器在磁力作用范围内的5个不同点相应的SERS光谱(图7)｡结果表明,4—MBA的SERS光谱在各点均有显著增强,5种SERS信号强度差异较小,在1597cm-1处,相对标准差(relativestandarddeviation,RSD)为3.2%｡结果表明,在磁力作用下,微通道免疫传感器具有良好的检测重复性,可用于肿瘤蛋白的定量检测｡

图7SERS免疫传感结构表面5个不同位置采集的SERS图谱

2.4微通道SERS免疫传感器的特异性评价

为了进一步证明SERS探针被AFP抗原特异性吸附,如图8所示,本文分别对以下样本进行了SERS测试:a为本文提出的SERS免疫传感器;b为吸附了AFP的磁性捕获基底;c为SERS免疫传感结构制备时未添加肿瘤标志物;d为利用癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)代替AFP制备SERS免疫传感器｡所用的肿瘤标志物的浓度均为10-6g/mL｡由图8可以发现,除本文所设计的三明治结构外,其他结构均没有观察到4—MBA的拉曼峰｡由此表明,SERS探针被AFP抗原特异性吸附在磁捕获底物上,进一步证明了所设计的三明治结构的特异性｡

图8相同测试条件下,不同结构表面测得的SERS图谱

3、结论

本文基于微流控芯片体积小､试剂消耗低､反应条件准确可控､抗体与抗原特异快速反应,在微通道中实现快速､可控､低成本的磁性SERS免疫传感器构建,磁场下AFP肿瘤标志物的可检测浓度降低至10-10g/mL,由于磁场下结构间距小产生大量“热点”,比无磁场低2个数量级｡更重要的是,在磁力作用下具有良好的检测重现性和特异性,所测到的SERS信号强度与抗原浓度呈正相关,相关系数为0.9943｡所开发的磁性SERS免疫传感器已被证明是一种高效的肿瘤蛋白检测结构,为未来可靠的早期癌症筛查提供了广阔前景｡

参考文献:

[15]金志明,徐林龙,张亚军,等.基于生物可降解微流控芯片的跨尺度注塑仿真[J].传感器与微系统,2023,42(3):15-18.

基金资助:重庆市教育委员会科学技术研究计划资助项目(KJQN202001122);重庆理工大学科研业务费基金启动项目(2017ZD41);重庆理工大学科研创新团队培育计划项目(2023TDZ012);

文章来源:王春艳,江怡娜,李希望,等.基于微通道的肿瘤标志物磁性SERS传感器制备[J].传感器与微系统,2025,44(06):43-46+50.