肺癌是世界上癌症死亡的主要原因，也是我国的一个主要健康问题，约占所有癌症相关死亡人数的28%[1]。肺癌的两种主要形式是小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其分别占所有病例的约15%和85%[2]。NSCLC通常会产生对放射和化疗的抵抗力，其整体5年生存率仅为15%，因此寻求新的治疗方法对于减少NSCLC的发病率是必要的。依托咪酯系一种催眠性静脉全麻药，是咪唑类衍生物，安全性大，是麻醉诱导常用的药物之一。近期研究发现，依托咪酯具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集和预防癌症的特性，其对肝癌、直肠癌和肺腺癌的发生及增殖活性具有抑制作用[3]。依托咪酯也具有抗炎和抗氧化作用。已证明丙泊酚可以抑制嗜中性粒细胞粘附于血管内皮细胞，清除氧自由基，减轻氧化损伤并减少炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6(IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的释放。临床上使用的丙泊酚浓度可促进细胞凋亡并抑制人类癌细胞的侵袭。在肺癌中，依托咪酯通过下调HOX转录反义RNA(HOTAIR）介导的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）途径降低细胞活力并诱导细胞凋亡。此外依托咪酯可以抑制核转录因子E2相关因子2(Nrf2），从而抑制肺癌细胞的增殖和侵袭[4]。PI3K/AKT途径是涉及许多类型肿瘤发生的主要信号传导途径。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是85-kDa和110-kDa亚基的异二聚体并且具有酪氨酸激酶活性。PI3K介导从生长因子受体到蛋白激酶B(AKT）的激活信号，AKT是一种转移到细胞核中的激酶，并磷酸化多种靶分子以介导信号[5]。PI3K/AKT途径在调节癌细胞功能中起着至关重要的作用，包括血管生成，细胞侵袭和转移，激活途径诱导上皮-间质转化（EMT）等。本研究拟探讨依托咪酯对PI3K/AKT通路及非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响，为非小细胞肺癌的治疗提供理论依据。

1、材料与方法

1.1主要药品、试剂与仪器：

依托咪酯、5-氟尿嘧啶（纯度99.99%，美国sigma公司，批号C7023、C5249);Dulbecco改良的Eagle培养基（美国LifeTechnologies公司，批号MN12657）；细胞计数试剂盒-8(CCK-8）、BCA蛋白质测定试剂盒、RIPA裂解缓冲液、ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号CK04-500、CM04-611、P0519、P0816F）；膜联蛋白V(AnnexinV）异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司，批号V13241);Transwell室（美国Corning公司，批号BH41785);TR-Izol试剂（美国Invitrogen公司，批号IK-0533);SYBRPrimeScriptmiRNART-PCR试剂盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（宝日医生物技术北京有限公司，批号RR716、RM5037）；抗p-PI3K、p-AKT、抗β-肌动蛋白（英国Abcam公司，批号ab14798、ab20158、ab30557）；辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠二抗（贵州赛兰博科技有限公司，批号AQ43095);680型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；BiosciencesAccuriC6型流式细胞仪（美国BDBiosciences公司）；徕卡DM2700P正立金相显微镜（德国徕卡公司）；LightCycler-480荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）。

1.2实验细胞培养及分组：

肺癌A549细胞购自中国医学科学院肿瘤细胞库。肺癌A549细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中生长，补充有10%热灭活的胎牛血清，置于37℃，5%CO2的环境中。5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组的肺癌A549细胞培养方法同肺癌A549细胞组，各组分别加入5-氟尿嘧啶以及不同浓度的依托咪酯，使得5-氟尿嘧啶组最终浓度为100.0μg/mL（预试验求出5-氟尿嘧啶对肺癌A549细胞的LC50为200.0μg/mL，以1/2LC50为作用剂量），依托咪酯低、高剂量组最终浓度为100.0μg/mL、200.0μg/mL（预试验求出依托咪酯对肺癌A549细胞的LC50为400.0μg/mL，以1/2LC50为高剂量，2倍间距求出低剂量）。以上各组每孔设6个平行样，培养72h。

1.3细胞活力测定：

通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8）测定评估细胞增殖。各组细胞培养结束后，将细胞以3.0×103个/孔接种在96孔板中，用等体积的含有10μLCCK-8的新鲜培养基替换100μL用过的培养基在37℃孵育1h。使用酶标仪在450nm波长下测量每个孔的吸光度（OD值）。计算细胞存活率，细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（A549细胞组OD-空白组OD）。每个测定重复6次。

1.4细胞凋亡水平测定：

使用膜联蛋白V(AnnexinV）异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒测定细胞的凋亡率。各组细胞培养结束后，收获细胞并重悬于500μL结合缓冲液中。将细胞悬浮液与5μL膜联蛋白V(AnnexinV）异硫氰酸荧光素（FITC）和碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂在暗处温育15min。向每个样品中加入50μg/mLPI，之后使用流式细胞仪测定MCF-7细胞的凋亡。

1.5细胞侵袭迁移能力的测定：

细胞培养结束后，收集细胞并以5×104个/mL的浓度重悬于无血清培养基中，然后将200μL细胞悬浮液加入上室中。在底室中填充500μL含有10%胎牛血清的培养基。温育24h后，用棉签除去未侵入的细胞，用结晶紫染色膜下表面的细胞并计数。

1.6细胞p-PI3K、p-AKTmRNA水平的测定：

根据制造商的方案，使用TRIzol试剂从组织细胞中提取总RNA。使用SYBRPrimeScriptmiRNART-PCR试剂盒从提取的RNA逆转录成cDNA。RT-qPCR反应的温度循环曲线如下：95℃持续30s;40个循环的95℃持续5s；和60℃持续20s。为了验证PCR产物的特异性，在扩增后立即进行熔解曲线分析，如下：加热至95℃20s；冷却至60℃，持续20s；加热至95℃，转换速率为0.11C/sec，同时连续采集荧光信号。所有反应均在LightCycler-480荧光定量PCR仪上进行，并一式三份。循环量化（Cq）值在三次重复中没有差异超过0.5。将靶基因的水平标准化为内部对照基因的水平，以允许计算2-ΔΔCq值。Cq定义为荧光通过固定阈值的分数循环数。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，U6为内参基因。引物序列如下：p-PI3K正向，5'-GAAAGTGCTTCCTTTTTAGGG-3'和反向，5'-CAAT-GAGTCGTCCTTTCCTTGGAATC-3';p-AKT正向，5'-CCGTGGTAGTCCTTCCTGAT-3'和反向，5'-TTGCAT-GCGTCCTTTCCTTCCTGAT-3';U6正向，5'-CTCGCT-TCGGCAGCACA-3'和反向，5'-ACGCTTCACGAATTT-GCGT-3'。

1.7细胞p-PI3K、p-AKT蛋白水平的测定：

用Hanks平衡盐溶液洗涤细胞两次，并在RIPA裂解缓冲液中裂解，并在13000g,4℃下离心20min。随后使用BCA蛋白质测定试剂盒根据制造商的说明书测定蛋白质浓度。将蛋白质样品（20μg）用4×上样缓冲液（TaKaRa）在95℃下变性5min。用补充有5%非磷酸盐的磷酸盐缓冲盐水（PBS）封闭PVDF。将等量的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将凝胶转移到PVDF膜上。然后将PVDF膜与下列抗体一起温育：抗p-PI3K(1:500稀释）、p-AKT(1:500稀释）和抗-β-肌动蛋白（1:2000稀释），在4℃下过夜。用含有5%Tween的PBS洗涤PVDF膜三次，并与辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠二抗在室温下孵育2h。根据制造商的说明，使用ECL化学发光试剂盒来显现蛋白质条带。使用Image-ProPlus6.0软件以β-actin作为内参蛋白分析相对蛋白质表达水平。

1.8统计学分析：

采用SPSS19.0对数据进行录入、统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析比较，多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1各组肺癌A549细胞OD值、存活率水平的比较：

与A549细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组OD值、存活率水平降低（P<0.05），且随着依托咪酯剂量的增加，依托咪酯各剂量组OD值、存活率逐渐降低（P<0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，依托咪酯低剂量组OD值、存活率水平升高（P<0.05），依托咪酯高剂量组OD值、存活率水平降低（P<0.05）。见表1。

表1各组肺癌A549细胞OD值存活率水平的比较

2.2各组肺癌A549细胞凋亡率水平的比较：

与A549细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组凋亡率水平升高（P<0.05），且随着依托咪酯剂量的增加，依托咪酯各剂量组凋亡率水平逐渐升高（P<0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，依托咪酯低剂量组凋亡率水平降低（P<0.05），依托咪酯高剂量组凋亡率水平升高（P<0.05）。见表2。

表2各组肺癌A549细胞凋亡率水平的比较

2.3各组肺癌A549细胞侵袭迁移能力的比较：

与A549细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组穿膜数降低（P<0.05），且随着依托咪酯剂量的增加，依托咪酯各剂量组穿膜数逐渐降低（P<0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，依托咪酯低剂量组穿膜数升高（P<0.01），依托咪酯高剂量组穿膜数降低（P<0.05）。见表3、图1。

2.4各组肺癌A549细胞p-PI3K、p-AKTmRNA的表达：

与A549细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组p-PI3K、p-AKTmRNA降低（P<0.05），且随着依托咪酯剂量的增加，依托咪酯各剂量组p-PI3K、p-AKTmRNA逐渐降低（P<0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，依托咪酯低剂量组p-PI3K、p-AKTmRNA升高（P<0.05），依托咪酯高剂量组p-PI3K、p-AKTmRNA降低（P<0.05）。见表4。

表3各组肺癌A549细胞侵袭迁移能力的比较

图1各组肺癌A549细胞穿膜数数目比较

表4各组肺癌A549细胞p-PI3Kp-AKTmRNA表达水平的表达

2.5各组肺癌A549细胞p-PI3K、p-AKT蛋白的表达：

与A549细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组p-PI3K、p-AKT蛋白降低（P<0.05），且随着依托咪酯剂量的增加，依托咪酯各剂量组p-PI3K、pAKT蛋白逐渐降低（P<0.05）；与5-氟尿嘧啶组比较，依托咪酯低剂量组p-PI3K、p-AKT蛋白升高（P<0.05），依托咪酯高剂量组p-PI3K、p-AKT蛋白降低（P<0.05）。见表5、图2。

表5各组肺癌A549细胞p-PI3Kp-AKT蛋白表达水平的表达

图2各组肺癌A549细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平的比较

3、讨论

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，近十年来，我国肺癌的发病率翻了一倍。最常见的肺癌类型是非小细胞肺癌（NSCLC），占病例的80-85%[6]。由于缺乏有效的治疗或早期诊断，NSCLC患者术后生存率较低，肿瘤转移和复发决定了患者的生存状况。因此寻求新的治疗手段对于NSCLC患者预后具有重要意义。依托咪酯已被证明在体内和体外具有癌症预防活性[7]。动物和细胞培养模型研究表明依托咪酯抑制肿瘤形成、癌症的发生和转移。依托咪酯通过增强GADD153mRNA的表达和转录活性，显著抑制前列腺DU145和LNCaP癌细胞的增殖，导致细胞周期停滞和抑制增殖[8]。此外，依托咪酯能够促进垂体瘤细胞凋亡[9]。有研究表明，依托咪酯参与调节关键信号通路，依托咪酯通过减少活性氧的生成来抑制LPS诱导的AKT活化和磷酸化，这对于巨噬细胞中LPS诱导的炎症反应至关重要。同时，低剂量依托咪酯预处理可增加细胞外信号调节激酶1/2的激活，抑制AKT的激活[10]。依托咪酯激活抑制PI3K/AKT途径，这被认为是癌症进展的关键环节。本次研究结果显示，与A549细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组OD值、存活率水平、穿膜数降低，凋亡率水平升高，且随着依托咪酯剂量的增加，依托咪酯各剂量组OD值、存活率、穿膜数逐渐降低，凋亡率水平逐渐升高；与5-氟尿嘧啶组比较，依托咪酯高剂量组OD值、存活率水平、穿膜数降低，凋亡率水平升高。这与上述讨论符合，同时提示，依托咪酯能抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭，促进肺癌A549细胞凋亡。

PI3K/AKT途径在调节生理和病理过程中起重要作用。在肿瘤发生和发展过程中，PI3K/AKT通路调节多种细胞行为，包括增殖，迁移和转移等。此外，PI3K/AKT途径被证明是调节癌细胞化疗耐药性的关键途径[11]。AKT是PI3K/AKT途径中的关键分子，其异常表达可直接影响PI3K/AKT途径的功能。AKT是一种新的肌动蛋白结合蛋白，参与肌动蛋白细胞骨架的形成并增强PI3K磷酸化。AKT也被证实是一种致癌基因，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用；在该过程中涉及大量信号传导途径，包括PI3K/AKT信号传导途径。AKT作用于PI3K结合并激活Gαi3，这是一种调节肿瘤细胞增殖和凋亡的经典信号通路[12]。体外细胞试验发现，AKT在胰腺癌组织和细胞中以高水平表达，并与胰腺癌恶性程度相关。此外，微阵列分析揭示了AKT水平与病理分级之间的正相关关系；AKT的表达与肿瘤恶性程度密切相关，包括组织学分级和转移，以及无进展生存期（PFS）和总生存期[13,14,15]。研究表明，AKT沉默通过PI3K/AKT信号通路抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。本次研究结果显示，与A549细胞组比较，5-氟尿嘧啶组、依托咪酯低、高剂量组pPI3K、p-AKTmRNA和蛋白降低，且随着依托咪酯剂量的增加，依托咪酯各剂量组p-PI3K、p-AKTmRNA和蛋白逐渐降低；与5-氟尿嘧啶组比较，依托咪酯高剂量组p-PI3K、p-AKTmRNA、蛋白降低。这提示依托咪酯通过减弱p-PI3K、p-AKTmRNA和蛋白磷酸化水平，进而抑制PI3K/AKT通路的激活传导。

综上所述，依托咪酯能抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭，促进肺癌A549细胞凋亡；其机制与依托咪酯通过减弱p-PI3K、p-AKTmRNA和蛋白磷酸化水平，进而抑制PI3K/AKT通路的激活传导有关。

参考文献：

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杜佳楠,戴勤学,容凤娇,徐夏.依托咪酯对PI3K/AKT通路及非小细胞肺癌A549细胞凋亡的影响[J].河北医学,2020,26(07):1066-1071.

基金:海南省卫生计生行业科研项目,(编号:18A200041)