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子宫内膜癌组织中miR-21、STAT3、FOXO3a的表达特点及临床意义

2020-08-21 352 上传者：管理员

摘要：目的：观察子宫内膜癌组织中微小RNA(miR-21）、信号转导和转录激活因子3(STAT3）、叉头框蛋白O3a(FOXO3a）表达特点，分析其与子宫内膜癌临床病理参数、预后的关系。方法：选取联勤保障部队第九八八医院2014年2月至2016年10月妇产科行经腹广泛或次广泛性全子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术切除，且经病理首次确诊为子宫内膜癌组织标本92例为子宫内膜癌组，另外选取门诊体检经宫腔镜取组织活检病理证实的正常子宫粘膜组织标本60例为对照组。应用实时RT-PCR技术分别检测子宫内膜癌及正常子宫膜中miR-21、STAT3、FOXO3a表达，并随访至2019年1月，统计分析上述三者与子宫内膜癌临床病理参数、预后的关系。结果：子宫内膜癌组miR-21、STAT3相对表达量高于对照组，FOXO3a则显著降低，差异均有统计学意义（P<0.001）。子宫内膜癌组miR-21、STAT3表达水平随着TNM分期增加、组织分化程度降低、浸润深度增加、淋巴转移而增高，FOXO3a下降，差异均有统计学意义（P<0.05），三者子宫内膜癌临床病理分型差异有统计学意义（P<0.05）。miR-21表达水平与STAT3表达水平呈正相关，FOXO3a与miR-21、STAT3表达水平呈负相关，差异均有统计学意义（P<0.05）。高表达miR-21、STAT3子宫内膜癌患者生存率低于低表达miR-21、STAT3组，差异有统计学意义（P<0.05），低表达FOXO3a组患者生存时间低于高表达FOXO3a组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-21、STAT3子宫内膜癌中高度表达，FOXO3a表达下调，miR-21、STAT3、FOXO3a表达水平与肿瘤侵袭转移等生物学行为密切相关，可作为临床诊断和预后预测的生物学指标。

关键词：
Foxo3a
miR-21
STAT3
子宫内膜癌
肿瘤
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子宫内膜癌是女性常见生殖系统恶性肿瘤，随着现代生活方式和压力的剧增，子宫内膜癌的发病率逐渐增高，且呈年轻化趋势发展，晚期及复发患者疗效和预后较差[1]。癌基因和抑癌基因在肿瘤形成发展中有重要作用，微小RNA(microRNA-21）是调控肿瘤组织分化、发育、代谢的致癌基因[2]，被证实在胃癌等多种恶性肿瘤组织呈高度表达[3]，但在子宫内膜癌致病机制尚不清楚。叉头框蛋白3a(FOXO3）参与细胞信号转导，具有抑制肿瘤细胞分化增殖、新生血管生成等作用，被认为是抑癌基因[4]。信号转导和转录激活因子3(STAT3）是JAK-STAT信号通路的转录因子，在肿瘤细胞存活、生长分化、侵袭转移和免疫逃逸过程中均有重要作用[5]。目前少有miR-21、STAT3、FOXO3a与子宫内膜癌的相关性研究，本研究拟探讨其在子宫内膜癌组织的表达特点，以及与临床病理参数、预后的关系，以期为临床诊治提供参考。

1、材料与方法

1.1标本来源

选取联勤保障部队第九八八医院2014年2月至2016年10月妇产科行经腹广泛或次广泛性全子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术切除，且经病理首次确诊为子宫内膜癌组织标本92例为子宫内膜癌组，年龄29～73岁，平均年龄（52.38±4.67）岁；已育56例，未育36例；孕1～5次，平均（2.03±0.57）次，产次0～3次，平均（1.23±0.68）次。纳入标准：(1)经组织病理确诊为子宫内膜癌；(2)有明确TNM分期；(3)术前未接受放化疗及激素治疗；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并其他部位肿瘤；(2)严重感染、血液系统、免疫系统疾病；(3)临床资料缺失，随访失联。病理分型：子宫内膜腺癌12例，鳞腺癌26例，透明细胞癌31例，浆液性癌23例。TNM分期Ⅰ期19例、Ⅱ期35例、Ⅲ-Ⅳ期38例；高分化癌29例、中分化癌36例、低分化癌27例；肌层浸润深度<1/2,53例，肌层浸润≥1/2,39例；发生淋巴结转移41例，无淋巴结转移51例。另外选取门诊体检经宫腔镜取组织活检病理证实的正常子宫粘膜组织标本60人为对照组，年龄32～78岁，平均年龄（54.05±5.12）岁，已育37例，未育23例；孕1～5次，平均（2.15±0.61），产0～4次，平均（1.15±0.63）次，两组年龄、孕育史基线资料对比均衡性良好，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究已获得本院伦理会批准，所有患者均知情同意并签署同意书。

1.2检测方法

选取100mg组织加1mLTRIzol试剂（美国Invitrogen公司）经匀浆、离心处理后取无色水相层，沉淀RNA，再次离心取沉淀物，洗涤，离心弃上清，室温下晾至沉淀物干燥，NanodropND-2000紫外分光光度法鉴定RNA纯度和完整性。ReverseTranscriptionKit（美国GIBICOL公司）将符合A260/A280nm≥1.8的RNA逆转录为cDNA，采用实时定量PCR系统定量7500PCR仪（美国ABI公司）进行RT-PCR反应，PrimerPremier5.0进行引物设计。琼脂糖凝胶电泳，以β-actin和U6分别作为mRNA和miRNA内参对照，紫外灯下观察结果。2-ΔΔCt法计算miR-21、FOXO3a、STAT3相对表达量。RT-PCR反应条件：95℃30s,95℃15s,72℃15s，共40个循环，引物序列：miR-21：上游5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'，下游5'-CUAUACAACCUACUACCUCAUU-3'，扩增182bp;FOXO3a：上游5'-TTGAAGCGGATGCCCAAATAA3'，下游5'-GCCGCACACGTATTTCTGGA3'，扩增169bp;STAT3：上游5'-TGTCCGTCGTGGATCTGAC-3'，下游5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'，扩增172bp；β-actin：上游5'-TGGCACCCAGCACAATGAA3'，下游5'-AATCCACGAGCACCCTGA-3'，扩增165bp;U6：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，扩增169bp。

1.3统计学分析

使用SPSS25.0统计软件进行数据分析，miR-21、FOXO3a、STAT3表达水平经Kolmogorov-Smirnov(K-S）法检验符合正态分布，levene法检验具备方差齐性，计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两对比采用LSD-t检验，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以率（%）表示，采用c2检验。Pearson相关数描述各变量之间相关性，Kaplan-Meier生存分析不同miR-21、FOXO3a、STAT3表达量下患者生存率，Log-Rank检验生存率的差异，所有统计均采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1miR-21、STAT3、FOXO3a在子宫内膜癌组和对照组的表达差异

子宫内膜癌组miR-21、STAT3相对表达量显著高于对照组，FOXO3a相对表达量明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.001），见表1。2.2miR-21、STAT3、FOXO3a与子宫内膜癌临床病理参数的关系子宫内膜癌组miR-21、STAT3表达水平随着TNM分期增加、组织分化程度降低、浸润深度增加、淋巴转移而增高，FOXO3a随着TNM分期增加、组织分化程度降低、浸润深度增加、淋巴转移而降低，差异均有统计学意义（P<0.05），三者在不同子宫内膜癌临床病理分型中的差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表1两组miR-21、STAT3、FOXO3a相对表达量差异

表2miR-21、STAT3、FOXO3a与子宫内膜癌临床病理参数的关系

2.3miR-21、STAT3、FOXO3a的相关性分析

Pearson双变量相关分析显示，子宫内膜癌组织miR-21表达水平与STAT3表达水平呈正相关（r=0.362,P<0.05),FOXO3a与miR-21、STAT3表达水平呈负相关（r=-0.326、-0.436,P<0.05）。

2.4miR-21、STAT3、FOXO3a表达与子宫内膜癌患者预后的关系

本组92例子宫内膜癌患者均随访至2019年1月，随访28～59月，中位随访37月。高表达miR-21、STAT3组患者生存时间低于低表达miR-21、STAT3组（Log-Rank检验P=0.035、0.015），低表达FOXO3a组患者生存时间低于高表达FOXO3a组（Log-Rank检验P=0.000），见图1。

3、讨论

miR-21是广泛存在人体组织的miRNAs，与肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等实体肿瘤以及血液肿瘤均有密切关系[6,7,8]。miR-21通过与信使RNA3'非翻译区特异性结合降解转录信使RNA，降低程序性细胞死亡基因表达，促进上皮细胞增生，从而达到调控基因表达目的[9,10]。本研究子宫内膜癌组中miR-21呈高度表达，其表达水平随着肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分化程度的加重而增高，说明miR-21参与子宫内膜癌的发生和进展过程，miR-21表达水平可作为判断和预测子宫内膜癌恶化程度和疾病进展的指标。本研究观察miR-21表达与子宫内膜癌患者预后密切相关，表现为高表达miR-21患者生存率偏低，而低表达miR-21生存率偏高，说明miR-21表达水平决定子宫内膜癌患者预后，分析原因为高表达miR-21正性调控肿瘤细胞增殖，与促进侵袭转移等恶性行为进展有关。

图1不同miR-21、STAT3、FOXO3a表达水平子宫内膜癌患者生存率的差异

STAT3是信号转导与转录活化因子家族成员，通过调控下游靶基因B淋巴细胞瘤-2基因、凋亡抑制基因、细胞周期蛋白D1促进恶性细胞增殖，调控癌细胞周期，参与肿瘤恶性生物学行为。相关研究发现STAT3也可通过上调基质金属蛋白酶类-2表达，降解肿瘤细胞基底膜和细胞外基质胶原蛋白、纤连蛋白，加速肿瘤侵袭与转移[11]。本研究发现STAT3在子宫内膜癌组织中表达明显上调，且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、分化程度有关，说明STAT3同样参与了子宫内膜癌发生和进展过程。通过随访发现STAT3表达水平与子宫内膜癌患者预后关系密切，高表达STAT3预示着较低的生存率，较高的死亡风险，相关性分析显示STAT3与miR-21呈正相关，提示STAT3与miR-21在子宫内膜癌发生发展中相互协同促进肿瘤的进展。STAT3结合位点位于miR-21启动子区域，miR-21通过STAT3信号通路发挥基因调控作用，同时miR-21转录受STAT3结合位点增强子调控，miR-21也可逆向调控STAT3，因此当STAT3信号通路被抑制后，miR-21表达便出现下调，相反，当miR-21表达上调时，可促使STAT3表达上调[12,13]。

FOXO3a具有调节人体代谢免疫、抑制老化进程、抗肿瘤等作用[14],FOXO3a通过降低细胞周期蛋白Cyclin表达水平抑制细胞周期进而抑制肿瘤增殖。同时FOXO3a是PI3K信号通路中的重要信号分子，通过磷酸化PI3K通路由细胞核进入胞质，使胞质失去活性，FOXO3a在乳癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中表达明显下调[15]。本研究发现FOXO3a在子宫内膜癌组织中表达明显下调，且随肿瘤进展表达水平持续降低，说明FOXO3a在子宫内膜癌发展过程中起负调控作用。相关性分析显示FOXO3a与miR-21、STAT3均呈负相关，提示FOXO3a与miR-21、STAT3在子宫内膜癌进程中存在某种协调或抑制机制。相关研究表明STAT3具有调节FOXO3a表达、转录FOXO3a活性作用[16],FOXO3a可下调miR-21表达引发细胞凋亡[17]。本研究观察不同FOXO3a表达水平患者生存率的差异，发现低表达FOXO3a患者生存率普遍偏低，提示FOXO3a表达水平与子宫内膜癌患者预后密切相关。

综上所述，本研究观察子宫内膜癌组织中miR-21、STAT3表达异常增高、FOXO3a下调，三者表达水平与子宫内膜癌发生和发展、预后密切相关，可作为子宫内膜癌诊断、预后预测的潜在生物学标志物。

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