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复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及其凋亡的机制研究

2020-08-26 138 上传者：管理员

摘要：目的：探讨复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其潜在的作用机制。方法：体外培养人肝癌HepG2细胞，取对数生长期细胞，将其消化后随机分为对照组，复方木鸡颗粒高、低（10、5mg/mL）剂量组，顺铂组（1mg/mL）和复方木鸡颗粒（5mg/mL）联合顺铂（1mg/mL）组，采用CCK-8法检测细胞增殖情况，采用Hoehcst染色法检测细胞凋亡情况，采用免疫荧光联合激光共聚焦分别检测各组细胞中凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、蛋白天冬氨酸蛋白水解酶-9（Caspase-9）、细胞色素C氧化酶（Cyt-C）表达水平。结果：与对照组比较，复方木鸡颗粒10、5mg/mL组及顺铂组、联合组的细胞活力显著降低（P<0.01），细胞凋亡显著增加，细胞内Bcl-2蛋白表达显著下调（P<0.05、0.01），而Bax、Caspase-9、Cyt-C蛋白显著上调（P<0.05、0.01），且联合组在抑制人肝癌HepG2细胞增殖、促进其凋亡、调控凋亡相关蛋白表达的作用效果最佳。结论：复方木鸡颗粒可显著抑制HepG2细胞增殖并促进其凋亡，其与顺铂联合起到协同增效的效果，其作用机制可能与下调人肝癌HepG2细胞内抑凋亡蛋白Bcl-2，上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Cyt-C表达水平有关。

关键词：
复方木鸡颗粒
细胞增殖
肝癌
肿瘤
顺铂
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肝癌是常见的恶性肿瘤，具有发病隐匿、致死率高的特点[1,2]。由于化疗药物不良反应较多且易耐药，目前西医尚无控制肝癌细胞增殖及转移的特效药物。因此，越来越多研究将传统中草药作为癌症治疗研究的重点。复方木鸡颗粒是著名满药，该药自1985年投放市场以来，在解放军第三〇二医院、上海复旦大学附属华山医院等多家三甲医院临床应用30多年，用于治疗肝癌疗效突出[3,4,5]。既往研究显示复方木鸡颗粒具有较强的抗肿瘤及调节免疫活性，但该药抗肝癌活性机制尚不明确，这可能限制其在临床的进一步发展。因此，本实验将研究复方木鸡颗粒对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响，初步探讨该药及其联合顺铂的抗肝癌机制，为该药在抗肿瘤领域的进一步开发利用奠定实验依据。

1、材料与方法

1.1细胞株

人肝癌HepG2细胞株，批号CL-0103，购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2药品与试剂

复方木鸡颗粒（丹东药业集团有限公司，4g/袋，批号180802）；顺铂（齐鲁制药有限公司，10mg/瓶，批号8CD214B02）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号10270106);DMEM培养基（美国Gibco公司，批号8119002);CCK-8(Bioss公司，批号A108014117);DAPI(Solarbio公司，批号20161111);Hoechst33258(Solarbio公司，批号B8030);Bcl-2相关X蛋白（Bax，货号50599-2-1g,proteintech）；蛋白天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9，货号10380-1-AP,proteintech）；细胞色素C氧化酶（Cyt-C，货号10933-1-AP,proteintech);B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2，货号AH08099535,Bioss公司）。

1.3主要仪器

Enspire全波长多功能酶标仪（美国Perkinelmer公司）；HERACE二氧化碳细胞培养箱（英国Thermo公司）；LSM800超高分辨率激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）；TDZ5-WS低速离心机（湖南湘仪仪器公司）。

1.4细胞培养与分组

取人肝癌HepG2细胞，采用DMEM高糖培养基（其中含10%FBS和1%双抗）于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，按适宜密度将细胞随机分为5组：对照组，复方木鸡颗粒高、低（10、5mg/mL）剂量组，顺铂组（1mg/mL）和复方木鸡颗粒（5mg/mL）联合顺铂（1mg/mL）组。

1.5CCK-8法检测HepG2细胞活力

待HepG2细胞生长至70%～80%融合程度时，0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞密度，按每孔5000个细胞接种于96孔培养板，静置培养18～24h，待细胞充分贴壁后，弃掉孔内液体，除对照组外，其余各组加入相应药物。继续培养24h后，弃掉孔内液体，然后加入完全培养基190μL，同时每孔加入10μLCCK-8溶液，于细胞培养箱中继续培养4h，最后用酶标仪于450nm波长下测定各孔的吸光度（A）值，扣除底板值，并计算各组细胞的相对存活率及药物抑制率。

1.6Hoechst染色法检测HepG2细胞凋亡

待HepG2细胞生长至70%～80%融合程度时，0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞密度，按每孔5000个细胞接种于黑色96孔培养板，静置培养18～24h，待细胞充分贴壁后，弃掉孔内液体，除对照组外，其余各组加入相应药物。继续培养24h后，弃掉孔内液体，冷0.01mol/LPBS润洗2次，4%多聚甲醛固定45min，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗3次，0.25%Triton-100处理15min，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗2次，每孔加入80μLHoechst33258工作液，室温避光孵育15min，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗5次，最后每孔加入50μLPBS，与激光共聚焦显微镜上进行荧光检测。

1.7免疫荧光染色法检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白表达水平

待HepG2细胞生长至70%～80%融合程度时，0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞密度，按每孔3000个细胞接种于96孔培养板，静置培养18～24h，待细胞充分贴壁后，弃掉孔内液体，除对照组外，其余各组加入相应药物。继续培养24h后，弃掉孔内液体，冷0.01mol/LPBS润洗2次，4%多聚甲醛固定45min，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗3次，0.25%Triton-100处理15min，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗2次，5%BSA封闭10min，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗1次，分别加入兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-9、Cyt-C一抗稀释液（体积比1∶100),4℃避光孵育过夜，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗5次，加入FITC标记的山羊抗兔二抗稀释液（体积比1∶400),37℃避光孵育30min，弃液，冷0.01mol/LPBS润洗5次，加入DAPI稀释液（体积比1∶800），室温避光孵育15min，弃液，冷0.01mol/LPBS洗4次，最后于激光共聚焦显微镜进行荧光检测，并以细胞平均荧光强度值反映各蛋白相对表达水平。

1.8统计学方法

采用SPSS26.0统计软件。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2、结果

2.1复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示，与对照组比较，复方木鸡颗粒10、5mg/mL组及顺铂组、复方木鸡颗粒+顺铂组人肝癌HepG2细胞活力均显著降低（P<0.01）；且与单纯顺铂组比较，复方木鸡颗粒+顺铂组更能有效抑制人肝癌HepG2细胞增殖（P<0.05）。见表1。

表1复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞增殖的影响（x±s,n=3)

2.2复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

与对照组比较，复方木鸡颗粒10、5mg/mL组及顺铂组、复方木鸡颗粒+顺铂组人肝癌HepG2细胞凋亡显著，细胞核浓缩、聚集，深染，同时呈现马蹄形或半月牙状的典型细胞凋亡特征，各组中尤以复方木鸡颗粒+顺铂组促进细胞凋亡作用更明显，见图1。

2.3复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

与对照组比较，复方木鸡颗粒10、5mg/mL组及顺铂组、复方木鸡颗粒+顺铂组人肝癌HepG2细胞内Bcl-2荧光强度值显著降低，而细胞内Bax、Caspase-9、Cyt-C荧光强度值明显升高。由于荧光强度值与蛋白表达水平呈正比，这提示复方木鸡颗粒能显著下调HepG2细胞内抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平（P<0.05、0.01），同时上调HepG2细胞内促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Cyt-C表达水平（P<0.05、0.01）。与顺铂组比较，复方木鸡颗粒+顺铂组更能起到协同增效的作用，其作用机制可能与调控人肝癌HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9、Cyt-C表达水平有关。见图2、表2。

3、讨论

肝癌是高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，目前手术治疗及放化疗存在一定的弊端，而中药对肿瘤存在多成分、多靶点的作用，在控制病情发展、改善症状等方面的优势日益凸显。复方木鸡颗粒由云芝、山豆根、菟丝子、核桃揪皮4味药组成。木鸡（云芝提取物）养肝散结，健脾除湿，为“君药”；核桃揪皮和山豆根清热解毒，为“臣药”；菟丝子保肝明目，为佐使药，佐制山豆根的苦寒太过。各味药相结合共收扶正固本，解毒散结之功效，临床常作为肝癌治疗药物[6,7,8,9,10]。细胞凋亡是一种由基因调控的细胞程序性死亡过程，与细胞增殖共同维持机体与细胞自身的稳态[11]。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡调节过程中的一类重要蛋白，该家族主要包括凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡促进蛋白Bax[12]。研究发现在外源性或内源性凋亡信号的刺激下，Bcl-2可通过与Bax结合形成Bcl-2-Bax异源二聚体，以抑制细胞凋亡过程的发生，此外Bax可通过转位并紧密结合到线粒体膜上，导致线粒体中的促凋亡蛋白细胞色素C(CytC）大量释放，并募集Caspase-9前体产生凋亡小体，激活凋亡执行Caspase-9，通过信号级联放大后，并以Caspase依赖性信号途径诱导细胞凋亡[13,14,15]。

图1复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

图2复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

表2复方木鸡颗粒联合顺铂对人肝癌HepG2细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响（x±s,n=3)

顺铂为临床常用的化疗药物，在肝癌的化学药物治疗中占有极其重要的地位，但由于其肾毒性、骨髓抑制等严重的毒副作用限制了其进一步推广使用[16,17]。为了探讨复方木鸡颗粒联合顺铂能否有效抑制人肝癌HepG2细胞，本文从细胞增殖和细胞凋亡两个层次验证了其作用效果及潜在机制。结果发现，与对照组比较，复方木鸡颗粒10、5mg/mL组、顺铂组、联合组细胞活力均显著降低、细胞凋亡显著增加，细胞内Bcl-2蛋白表达显著下调，而Bax、Caspase-9、Cyt-C蛋白显著上调，且复方木鸡颗粒联合顺铂在抑制人肝癌HepG2细胞增殖、促进其凋亡、调控凋亡相关蛋白表达的作用效果更佳，这提示复方木鸡颗粒可显著抑制HepG2细胞增殖并促进其凋亡，且复方木鸡颗粒与顺铂联合起到协同增效减毒的作用，顺铂通过与复方木鸡颗粒配伍应用，能够降低顺铂的使用剂量，减少其毒副作用，为临床两药的合理配伍使用治疗肝癌提供了实验依据。

综上所述，复方木鸡颗粒可显著抑制HepG2细胞增殖并促进其凋亡，与顺铂联合起到协同增效的作用效果，其作用机制可能与调控内源性凋亡途径Bcl-2/Bax-Cyt-C/Caspase-9有关，后续将进一步研究其深层作用机制。

参考文献：

[1]吕桂帅,陈磊,王红阳.我国肝癌研究的现状与前景[J].生命科学,2015,27(3):237-248.

[2]高苗苗,徐芳野,木合布力·阿布力孜.肝癌治疗靶点及肝靶向抗癌药物研究进展[J].新疆医科大学学报,2012,35(2):146-152.

[3]刘永久,杨良.复方木鸡颗粒治疗肝炎AFP低持阳者疗效分析[J].中成药,2001,23(4):302-303.

[4]金黎明,胡文忠,侯梦阳.满药复方木鸡颗粒防治肝病的研究进展[J].广州中医药大学学报,2017,34(2):292-296.

[5]吴海江,崔宁,曹弛,等.介入治疗加服复方木鸡冲剂治疗原发性肝癌的临床观察[J].中国医药,2008,3(12):792-793.

[6]刘瑞,侯亚义,张伟云,等.云芝子实体提取物的抗肿瘤作用研究[J].医学研究生学报,2004,17(5):413-415.

[7]吴宜艳,郑科文,侯甲福,等.核桃楸含药血清对体外培养肝癌细胞增殖的影响[J].中国中医药科技,2012,19(2):128.

[8]常乐,孟楠,雷涛,等.核桃楸皮药理作用的研究概述[J].中国医药导报,2013,10(1):23-24.

[9]肖正明,宋景贵,徐朝晖,等.山豆根水提物对体外培养人肝癌细胞增殖及代谢的影响[J].山东中医药大学学报,2000,24(1):62-64.

[10]牟洪香,王李鸣,刘大伟,等.菟丝子对D-半乳糖致衰大鼠肝脏氧化损伤保护作用的研究[J].黑龙江医药科学,2014,37(4):25-26.