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结直肠癌MMR表达及预后与Survivin-31GC基因多态性的相关性分析

2020-08-29 215 上传者：管理员

摘要：目的探讨Survivin-31G/C多态性对结直肠癌(CRC)患者微卫星不稳定(MSI)、化疗敏感度及临床预后的影响。方法选取已行Survivin-31G/C基因分型并以奥沙利铂为主要化疗药物的CRC患者158例作为研究对象，分型结果CC基因型64例、GC基因型61例、GG基因型33例，采用免疫组织化学(IHC)分析3种不同基因型患者间MSI状态，并随访其治疗效果及复发转移等生存情况。结果 GG基因型患者MSI-H表型明显高于CC、GC基因型；CC基因型患者的化疗敏感度明显低于GG基因型患者，生存时间短于GG基因型，复发或转移风险高于GG基因型患者。结论 Survivin-31G/C的多态性可能影响CRC的MSI表型、化疗敏感度及临床预后，其位点基因型分析可作为判断CRC患者预后的方法之一。

关键词：
Survivin
化疗
多态性
微卫星不稳定
结直肠癌
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结直肠癌（CRC）是全球男性癌症死亡的第四大原因，女性癌症死亡的第三大原因[1]。奥沙利铂联合五氟尿嘧啶是术后化疗的主要方案，能显著改善CRC患者治疗效果，但固有或获得性的肿瘤细胞耐药往往导致术后化疗失败，进而发生复发和转移。奥沙利铂耐药机制涉及转运改变、解毒、细胞死亡（凋亡和非凋亡）、DNA损伤和修复及表观遗传修饰等方面[2]。Survivin作为一种凋亡抑制剂，其蛋白过表达与CRC及其他某些恶性肿瘤化疗耐药及预后不良相关[3,4]。体外实验发现，与亲代细胞比较，获得性奥沙利铂耐药的CRC细胞系中Survivin蛋白水平更高[5]。meta分析发现Survivin-31G/C多态性可能影响CRC的发生，CC基因型为风险基因型，尤其是在亚洲人群中[6]。也有研究表明，Survivin-31CC基因型增加了中国人群CRC的患病风险，CC基因型患者的Survivin蛋白水平明显高于GC和GG基因型患者[7]。作者推测，Survivin基因-31G/C的不同基因型可能预示着CRC对奥沙利铂类化疗的不同反应及患者的不同预后。

DNA修复能力的差异将导致铂类药物临床疗效的差异，核苷酸切除修复（NER）通路和错配修复（MMR）通路参与了铂类化疗药物的疗效[2]。目前，临床病理检测采用免疫组织化学（IHC）检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表达或缺失，间接地检测微卫星不稳定（MSI）状态。MSI可以预测奥沙利铂类化疗的疗效，MSI-H患者对化学反应更为敏感[8]。在生存预测方面，不同Survivin-31G/C基因型的CRC患者其MSI状态尚未见分析。本研究旨在探讨Survivin-31G/C基因多态性对CRC患者MSI、化疗敏感度及临床预后的影响。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2010年1月至2012年3月西南医科大学附属医院CRC患者275例作为研究对象，患者均已接受Survivin-31G/C基因型分析。排除117例临床资料及随访不完整病例，其余158例CRC病例（CC基因型64例，GC基因型号61例，GG基因型33例）纳入本研究。研究前所有患者均签署知情同意书，试验方案经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1IHC检测MSI表型

将研究对象手术标本切片烤干后脱蜡脱苯水化，用高压锅在乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（pH9.0）中上汽6min后自然冷却。滴加小鼠抗人单克隆抗体MLH1、MSH2、MSH6、PMS2（克隆G168-15、25D12、EP51、MOR4G,Dako,DK),37℃孵育60min。磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗后用二抗[EnVision，辣根过氧化物酶（HRP)rabbit/mouse,DAKO]在37℃孵育20min。PBS代替一抗滴加，作为阴性对照。二氨基联苯胺（DAB）显色后苏木素染色。在内对照（正常肠道腺上皮和间质细胞）细胞核着色良好情况下，肿瘤细胞核着色计为阳性，无着色为阴性。任何一种蛋白表达阴性判为MMR蛋白缺失（即MSI），存在2个或2个以上蛋白缺失为MSI-H，存在1个蛋白缺失为MSI-L，无蛋白缺失为MSS。

1.2.2化疗治疗及患者随访

受试者接受至少2个周期以奥沙利铂为主的化疗，通过门诊复诊和电话回访方式随访至2018年3月。收集基本资料、肿瘤特征、治疗反应、复发和转移情况等，了解相关风险因素，如吸烟、饮酒等。治疗反应效果基于临床医生的评估分为敏感和耐药。随访患者进行生存分析，包括总生存时间（OS）和无事件生存时间（EFS）。OS指从诊断明确至因任何原因引起患者死亡的时间。EFS指从诊断到复发、转移或死亡的时间[9]。

1.3统计学处理

采用统计学软件SPSS17.0进行分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。采用无条件logistic回归模型估计某一基因型与化疗反应的相关性。根据年龄、性别、饮酒和吸烟情况调整95%置信区间（95%CI）的优势比（OR）。采用Kaplan-Meier法、Log-rank检验和Cox回归模型评价单核苷酸多态性对生存率的影响。应用Kaplan-Meier法推导出OS和EFS的生存曲线。采用95%CI的危险度比（HR）估计死亡、复发和转移的相对危险度。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.13种基因型CRC患者MSI表型

本研究共纳入158例CRC患者，CC基因型64例，GC基因型61例，GG基因型33例，基本特征见表1。Survivin-31的3个基因型患者在年龄、性别、吸烟、饮酒等方面比较差异均无统计学意义（P>0.05),3组间具有可比性。在158例患者中，28例（17.7%）被发现存在MSI状态，其中15例（9.5%,CC基因型4例，GC基因型4例，GG基因型7例）为MSI-H表型，13例（8.2%,CC基因型6例，GC基因型5例，GG基因型2例）为MSI-L，其余130例（82.3%）为MSS。在所有的MSI-H表型中，GG基因型患者明显多于CC和GC基因型患者，差异有统计学意义（χ2=6.670,P=0.036）。见表2。

表1研究人群的基本特征

表2MSI与Survivin-31G/C基因型的关系

2.23种基因型CRC患者的化疗疗效

所有患者术后均接受以奥沙利铂为主的化疗方案。至随访结束共70例（CC基因型21例，GC基因型28例，GG基因型21例）患者对化疗敏感，总有效率为44.3%。3种不同基因型患者有效率分别为：CC基因型32.8%,GC基因型45.9%,GG基因型63.6%。CC基因型与化疗耐药关系密切（67.2%),GG基因型与化疗耐药关系较弱（36.4%),2组间化疗反应比较差异有统计学意义（P=0.017），说明Survivin-31G/C基因多态性与化疗疗效相关。见表3。

2.33组CRC患者预后比较

158例CRC患者随访时间8～72个月，OS、EFS随访平均数56.7、53.9个月。随访截止时，CC基因型死亡42例（65.6%),GC基因型死亡28例（45.9%),GG基因型死亡9例（27.3%),3组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。3种基因型的6年无病生存率分别为29.7%(19/64）、47.5%(29/61）和60.6%(20/33),CC基因型和GG基因型间比较差异有统计学意义（χ2=7.914,P=0.019）。COX回归分析基本临床特征对OS、EFS的影响，结果显示，性别、饮酒、吸烟状况、TNM分期和肿瘤部位与OS和EFS相关；男性、吸烟者、饮酒者、晚期TNM和结肠肿瘤与OS和EFS缩短有关。见表4。COX回归分析Survivin-31G/C基因型对CRC患者OS和EFS的影响，结果显示，与GG基因型比较，CC基因型患者的生存率较低（HR=0.339,95%CI为0.161～0.716,P=0.005）；在EFS分析中，CC基因型携带者的复发或转移风险较高（HR=0.441,95%CI为0.235～0.830,P=0.011）。见表5。OS和EFS的单变量Kaplan-Meier图也反映了这些趋势，见图1。Survivin-31G/C基因多态性与CRC患者OS和EFS显著相关。与GG基因型比较，CC基因型患者存活时间较短，复发或转移风险较高。

表33组基因型CRC患者化疗反应

表4影响CRC患者OS和EFS的临床特征

表5Survivin-31G/CSNP与患者OS和EFS相关分析

图1OS和EFS的单变量Kaplan-Meier图

3、讨论

Survivin在人类恶性肿瘤过表达的主要机制是转录异常。该基因启动子区细胞周期依赖性元件（CDE）/细胞周期基因同源区（CHR）抑制剂介导Survivin的转录。Survivin-31G/C多态性与CDE/CHR抑制剂结合序列和启动子活性的改变有关。该SNP位点的G等位基因可以形成CDE，影响Survivin的转录；而C等位基因不能形成这种抑制因子，导致CC基因型患者Survivin蛋白水平高于GC和GG基因型患者[10]，进而可能影响患者的其他蛋白表达情况、临床治疗疗效和生存预后。

在本研究中，17.7%的CRC患者为MSI表型，略高于15%的平均水平；其中9.5%为MSI-H,8.2%为MSI-L，且GG基因型MSI-H患者的比例明显高于CC基因型患者。既往研究发现，MSI-HCRC患者较MSI-L不易发生淋巴结和肝转移，且对以奥沙利铂为主的化疗更敏感，MSI-H患者具有良好的预后[11]。Survivin和MMR在恶性肿瘤病情进展中的作用截然相反，将Survivin蛋白和MMR联系在一起的是P53蛋白[12]。P53作为抑癌基因参与细胞周期调控、DNA损伤修复和凋亡诱导，其对DNA损伤的反应、修复和复制启动大多通过与MMR基因和蛋白的相互作用来实现[13]。研究表明，DNA损伤的结果是P53在其活性状态下抑制细胞周期，将必要的MMR蛋白招募到损伤区域，并诱导这些MMR基因的转录激活[14]。另一方面，较多的研究证实Survivin启动子上有P53结合位点，野生型P53可以抑制Survivin的转录活性，其抑制表达的机制十分复杂，至今仍无定论。P53基因突变存在于多数人类肿瘤中，不同肿瘤组织中P53与Survivin关系不一致。既往研究认为，在肠癌中P53与Survivin无相关性。但其后研究发现，两者表达相关，如闫世贤等[15]研究结果显示，Survivin蛋白、P53蛋白在CRC组织中的表达呈正相关。而MAHDAVINIA等[16]发现P53蛋白与MSI-H呈负相关。MMR通过被野生型P53激活来参与细胞凋亡的调控，并通过这种间接机制抑制Survivin的抗凋亡功能。本研究发现，风险基因型———CC基因型CRC患者中，MSI-H比例较低，预示该基因型患者具有较差的预后。Survivin-31G/C的不同基因型如何影响MMR的状态还有待进一步研究。

作者随访发现，Survivin-31G/CSNP与治疗反应、OS和EFS有关。CC基因型携带者更易发生化疗抵抗、复发和转移，进而缩短生存期，这可能是因为CC基因型CRC患者高表达Survivin蛋白。国外研究发现，与奥沙利铂耐药相关的分子机制包括DNA修复机制、凋亡机制和非凋亡机制的改变，Survivin的过表达与多种癌症的化疗耐药有关[17,18]。Survivin促进肿瘤细胞生长和抗肿瘤药物耐药的机制是通过直接抑制caspase和pro-caspase信号，导致多药耐药通路的激活，包括多药耐药蛋白-1、蛋白-2和p-糖蛋白信号通路[19]。体外实验表明，奥沙利铂可降低HCT116结肠癌细胞中Survivin的表达[20]。此外，LIU等[21]发现奥沙利铂能显著降低Survivin在人结肠癌细胞中的表达，奥沙利铂阻断Survivin后可提高人结肠癌细胞caspase-3的活化和凋亡；转染Survivin表达载体后，Survivin过表达抑制了奥沙利铂诱导的癌细胞凋亡。作者的随访结果也显示，Survivin过表达的CC基因型患者对奥沙利铂的耐受性明显高于GG基因型患者，对化疗的耐药进一步导致复发、转移和生存期缩短。

综上所述，奥沙利铂作为能诱导DNA损伤的第三代铂类抗肿瘤药物，目前已广泛应用于临床。Survivin作为一种在CRC患者肿瘤组织高表达的抗凋亡蛋白，对奥沙利铂诱导的肿瘤细胞损伤和死亡发挥拮抗作用。Survivin-31G/C基因多态性可能调节其蛋白表达，影响CRC易感性、MSI表型、化疗效果和临床预后。作者的研究结果有待更大样本量的试验进一步验证。

参考文献:

[15]闫世贤,王大广,刘娜,等.Survivin蛋白和P53蛋白在结直肠癌中的表达及其对预后的影响[J].胃肠病学和肝病学杂志,2017,26(4):423-427.

李霞斌,杨紫汐,文雪,孙兴旺.Survivin-31G/C基因多态性与结直肠癌MMR表达及预后的相关性研究[J].现代医药卫生,2020(16):2524-2527+2530.

基金:四川省泸州市科技局项目(2013LZLY-J36);泸州医学院院级基金项目(2014QN-028)