全球癌症数据表明，肺癌的发病率仅次于乳腺癌，位于第2位，但死亡率却最高[1]。肺癌包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌，非小细胞肺癌约占肺癌的85%,其中肺腺癌是最常见的病理类型[2]。目前肺腺癌的临床治疗虽然取得了一些进展[3],但晚期肺腺癌患者5年生存率仍然低，因此肺腺癌研究需要更多的研究策略。

IL-9是一种多效性的T细胞生长因子[4],可由不同免疫细胞分泌，如Th9细胞、Ⅱ型先天淋巴样细胞(ILC2)和肥大细胞等[5]。IL-9通过与其异二聚体受体L-9R结合，发挥多种生物学功能，该受体包含一条特异链(IL-9Ra)和一条共同γ链[6]。IL-9可改变多种表达IL-9R细胞的功能，如通过促进肥大细胞的活化和增强Treg细胞的存活，从而参与炎症性疾病的发生[7]。近几年的研究发现，在不同的肿瘤微环境中IL-9可表现出抗肿瘤或促肿瘤的复杂作用[8]。IL-9可以通过抑制适应性免疫应答或阻断肿瘤特异性免疫记忆的建立来促进乳腺癌的发展[9]。在慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B淋巴瘤等血液肿瘤中，通常认为IL-9通过其淋巴细胞生长因子功能促进肿瘤生长[10-12]。在皮下B16小鼠黑色素瘤模型中，IL-9通过激活肥大细胞来发挥抗肿瘤作用[13]。另外，还有研究报道，IL-9通过促进树突状细胞募集，增强肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，从而抑制肿瘤的生长[14-15]。

近年来对IL-9在肺腺癌中作用的研究存在很大的争议[16-17],需要进一步的研究来充分了解IL-9在肺腺癌中的作用。本文通过构建小鼠肺腺癌移植瘤模型，探讨IL-9对小鼠肺腺癌生长的影响及其可能的作用机制，旨在为肺腺癌的治疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1主要试剂

新生牛血清购自上海依科赛生物科技有限公司；DMEM高糖培养液购自中国Hyclone公司；GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；IL-9R抗体购自ABclonal有限公司；重组蛋白IL-9购自PeproTech公司；PVDF(聚偏二氟乙烯)膜和ECL发光试剂购自美国Millipore公司；CCK-8试剂盒购自白鲨生物公司；膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双染细胞凋亡检测试剂盒、PBS溶液、0.25%含EDTA的胰酶组织细胞消化液、聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配置试剂盒、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂、上样缓冲液、HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG购于中国碧云天生物技术有限公司；CD11b-PE单克隆抗体、Gr1-APC单克隆抗体、CD3-PE单克隆抗体、CD4-FITC单克隆抗体和CD8-APC单克隆抗体均购自美国Biolegend公司，流式抗体工作液质量浓度为2μg/mL。

1.2细胞培养

小鼠肺腺癌CMT167细胞株为贴壁细胞，购自广州吉妮欧生物科技有限公司，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养液置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，用0.25%含EDTA的胰酶进行消化，隔日进行一次传代，收集对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3小鼠皮下移植瘤种植

1.3.1实验动物来源及饲养

实验动物为10只6周龄、体重为15～18 g的雌性BALB/C小鼠，购自济南朋悦实验动物有限公司(实验动物生产许可证号：No.370726230101177437)。在室温25℃、相对湿度为40%～70%、12 h明暗交替的SPF级环境下饲养，所有动物均可自由饮水和取食，且与动物实验相关的操作均符合动物伦理要求。

1.3.2实验动物与分组

首先制备肿瘤细胞悬液，将处于对数生长期的CMT167细胞消化并离心后，弃掉含血清培养液，用PBS重悬细胞，并调整细胞浓度为2×107个/mL,将制备好的细胞悬液放置于冰上。然后使用电推剪对小鼠右侧进行剃毛，用乙醇棉球对其皮肤进行消毒并擦拭掉残留毛发，随后选取小鼠右侧臀部上方皮下位置作为进针点，注射器水平向前推进大概1 cm,并缓慢推注150μL的细胞悬液，旋转拔出针头后，用棉签按压进针点2～3 s,以防止细胞悬液漏出。接种完成后注意观察小鼠状态的变化，30 min后待各项反应正常，放回笼内继续饲养，用于后续实验。小鼠接种CMT167细胞第6天，皮下移植瘤体积约为50～100 mm3,将小鼠随机分为2组(每组5只):模型对照组(对照组)和治疗组，分别腹腔注射PBS溶液和IL-9(5.5μg/kg),每2天注射1次，共给药5次。每隔2天用游标卡尺测量1次小鼠肿瘤长径和短径，使用公式：(长径×短径2)/2计算肿瘤体积。治疗结束后拍照，记录肿瘤大小。

1.4蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测蛋白表达

取小鼠脾脏组织进行匀浆，取匀浆和(或)CMT167细胞提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白在10%的SDS-PAGE凝胶中电泳分离(70V 30 min, 110V 1h),转移到PVDF膜上(200 mA,2 h),用5%工业脱脂奶粉室温封闭2 h后，一抗(GAPDH 1∶50000,IL-9R 1∶1000)4℃孵育过夜，TBST洗涤30 min后，用HRP标记的二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG 1∶5000,HRP-山羊抗兔IgG 1∶5000)室温孵育1 h,使用增强化学发光法曝光显影条带。

1.5流式细胞术检测细胞表面IL-9R的表达

收集对数生长期的CMT167细胞于流式管中，PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×106个/mL。加入浓度为0.2μg/mL的IL-9R-APC抗体与同型对照IgG1抗体进行染色，每个样品设置2个重复样品管，染色结束后用PBS洗涤2次，加入300μL 2%多聚甲醛溶液固定细胞，上流式细胞仪检测IL-9R的表达水平，用FlowJo VX软件分析检测结果。

1.6 CCK-8法检测细胞活力

在96孔板中接种100μL浓度为3×104/mL对数生长期的CMT167细胞悬液，在37℃培养箱培养3 h使细胞贴壁，然后加入不同浓度的IL-9(10、30、50、70、100 ng/mL)处理，放入37℃培养箱继续培养，不同时间点(24、48、72 h)后取出细胞进行后续实验。取10μL CCK-8溶液加入96孔板中，在37℃培养箱中继续孵育2 h,采用酶标仪测量各孔在450 nm波长处的吸光度值(A450 nm)。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡率

在6孔板中接种2 mL浓度为2×105/mL对数生长期的CMT167细胞悬液，待贴壁后加入不同浓度的IL-9(10、30、50、70、100 ng/mL)处理，放入37℃培养箱继续培养，48 h后收集细胞于流式管中，PBS洗涤后加入Annexin-Ⅴ-FITC和PI染色液室温避光染色15 min,上流式细胞仪检测细胞凋亡率，用FlowJo VX软件分析检测结果。

1.8流式细胞术检测肺腺癌移植瘤小鼠肿瘤中的骨髓来源免疫抑制性细胞(MDSCs)和T细胞

小鼠经颈椎脱位处死后，在75%乙醇中浸泡30 s,取出各组肿瘤组织于PBS中清洗，随后转置于1.5 mL EP管中用剪刀剪碎，再加入胶原酶、透明质酸酶和DNA酶Ⅰ,放入37℃培养箱中消化40 min。消化完毕后，用注射器活塞底部在尼龙纱布上轻轻按压得到研磨碎的肿瘤组织单细胞悬液。将肿瘤组织单细胞悬液通过200目的滤网过滤后离心，再加入2 mL红细胞裂解液，吹打混匀，将红细胞彻底裂解，5 min后终止裂解红细胞，并加入2倍体积的PBS溶液，离心后待下一步染色标记小鼠肿瘤组织中的MDSCs和T细胞：染色方法和抗体工作液稀释比例参照抗体使用说明书(CD11b-PE单克隆抗体、Gr1-APC单克隆抗体、CD3-PE单克隆抗体、CD4-FITC单克隆抗体和CD8-APC单克隆抗体)。上流式细胞仪检测MDSCs和TILs数量，即检测计数CD11b+Gr1+细胞、CD4+和CD8+细胞所占的百分比。

1.9统计学方法

运用Graph Pad Prism 9软件进行数据分析。各实验均独立重复3次，数据以均数±标准差

表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两组数据间均数的比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 IL-9抑制小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生长

为探讨IL-9对肺腺癌生长的影响，我们构建了小鼠CMT167细胞皮下移植瘤模型。IL-9组在移植瘤成功接种后的第6天开始腹腔注射IL-9,每隔2天给药一次，共给药5次(图1A)。给药的同时测量肿瘤的长径和短径，并绘制小鼠肿瘤生长曲线图。结果(图1B、1C)显示，IL-9明显减小CMT167细胞皮下移植瘤的体积(P<0.01)。对小鼠移植瘤重量的分析结果(图1 D)显示，与对照组相比，IL-9治疗组小鼠移植瘤的重量明显降低(P<0.01)。上述结果表明，IL-9可抑制小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生长。

图1IL-9抑制小鼠肺腺癌皮下移植瘤的生长

2.2小鼠肺腺癌CMT167细胞中IL-9R表达明显上升

为探讨IL-9抑制小鼠肺腺癌细胞生长的机制，本研究检测了小鼠肺腺癌CMT167细胞IL-9R的表达水平。取对数生长期的CMT167细胞，用IL-9R-APC单克隆抗体和同型对照IgG1抗体染色后，在流式细胞仪上检测IL-9R的表达。结果显示，CMT167细胞中IL-9R表达明显上升(图2A)。此外，蛋白免疫印迹的结果也显示CMT167细胞表达IL-9R(图2B,其中图中以已被证明表达IL-9R的小鼠脾细胞作为阳性对照)。

图2小鼠肺腺癌CMT167细胞中IL-9R表达明显上升

2.3小鼠肺腺癌CMT167细胞的活力和凋亡不受外源性IL-9影响

IL-9作用于CMT167细胞24、48、72 h后，随着IL-9浓度的增加，CMT167细胞的活力未受到影响(P>0.05)(图3A)。IL-9作用于CMT167细胞48 h,随着IL-9浓度的增加，CMT167细胞的凋亡同样未受到影响(P>0.05)(图3B、3C)。上述结果显示，外源性IL-9对小鼠肺腺癌CMT167细胞的活力和凋亡没有影响。

图3小鼠肺腺癌CMT167细胞的活力和凋亡未受到外源性IL-9作用影响

2.4 IL-9降低肺腺癌移植瘤小鼠肿瘤组织中MDSCs数量并增加T细胞比例

考虑到IL-9对CMT167细胞本身生长并无影响，我们接下来检测IL-9对肿瘤微环境中免疫细胞的影响。FCM检测结果(图4A)显示，与对照组比较，IL-9组中MDSCs(即CD11b+Gr1+细胞)所占百分比降低(P<0.05),提示IL-9治疗可降低肿瘤组织中MDSCs数量。为了检测IL-9对体内抗肿瘤免疫的影响，FCM结果显示(图4B),与对照组相比，CD4+T细胞、CD8+T细胞的百分比均增加(P<0.05,P<0.01),且CD8+T细胞增加更加明显，提示IL-9可能通过降低MDSCs数量和(或)促进T细胞反应来抑制小鼠皮下肺腺癌移植瘤的生长。

图4IL-9对肺腺癌移植瘤小鼠的肿瘤组织中MDSCs、CD4+T细胞和CD8+T细胞占比的影响

3、讨论

近年来，IL-9在肿瘤免疫中的作用备受关注，它是一种潜在的T细胞生长因子，通过与其受体结合，激活JAK/STAT通路调节多种细胞的功能[18]。IL-9在肺癌的发生发展中表现出复杂的双重作用，在不同的肿瘤微环境中能够促进或抑制肿瘤细胞的生长[8,19-20]。本研究利用小鼠肺腺癌CMT167移植瘤模型，探讨IL-9在肺腺癌中的作用，研究发现IL-9能够显著抑制肺腺癌皮下移植瘤的生长。为探讨相应的作用机制，本研究证明了CMT167细胞表达IL-9R。体外实验中IL-9对肺腺癌CMT167细胞的增殖与凋亡无明显影响，这提示IL-9可能通过影响肿瘤微环境从而抑制肿瘤生长。

MDSCs是一群不成熟的髓性细胞，能够抑制T细胞免疫功能，促进肿瘤血管生成及肿瘤生长[21-22]。以往的研究已经证明，肿瘤患者外周血、脾脏及肿瘤组织中MDSCs表达显著升高，且与患者不良预后密切相关[23-24]。本研究发现，与对照组小鼠相比，IL-9治疗后的小鼠肿瘤组织中MDSCs数量明显降低，这说明IL-9可能通过减少肿瘤微环境中MDSCs的数量，从而抑制肿瘤生长。

T淋巴细胞在机体抗肿瘤作用中发挥着重要的免疫调控作用，CD4+T细胞通过直接或间接的方式参与抗肿瘤免疫调控，CD8+T细胞通过分泌大量的干扰素-γ、穿孔素和颗粒酶B直接杀伤肿瘤细胞。既往的研究表明，IL-9能够通过调控CD4+T细胞和CD8+T细胞数量的变化影响肿瘤的生长[25-28]。本研究结果显示，与对照组相比，IL-9治疗后的小鼠肺腺癌移植瘤中CD4+T细胞和CD8+T细胞数量均升高，但CD8+T细胞数量升高更加明显，这说明IL-9能够增强T细胞浸润的能力，从而抑制肿瘤生长。

在本实验肺腺癌皮下移植瘤的研究中，IL-9产生的效应可能不依赖于其对肿瘤细胞的直接作用，而是依赖于IL-9对肿瘤微环境的影响。由于皮下移植瘤模型具有容易建立、耗时短且易于观察的优点。因此，本研究采用此模型探讨IL-9在肺腺癌中的作用，但与原位移植瘤及原发性肿瘤相比，皮下移植瘤的微环境可能存在一定的差异。因此为探讨IL-9在肺腺癌中的准确作用，还需构建原位肿瘤实验模型。

总之，本研究结果表明，IL-9能够抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长，这可能与其降低肿瘤组织中MDSCs的数量，增加CD4+T细胞和CD8+T细胞比例有关。这一研究结果为IL-9用于临床肺腺癌治疗提供了理论和实验依据。

参考文献:

[20]高媛,周妍,周新佳,等.白细胞介素-9及其受体在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J].中国医科大学学报,2021,50(6):511-515.

[25]柯有力,罗东,刘旭.lncRNA SMAD5-AS1在肺腺癌细胞中的表达及其通过Wnt/β-catenin通路对癌细胞增殖､侵袭､迁移的影响[J].华中科技大学学报:医学版,2023,52(1):7-13.

基金资助:安徽高校自然科学研究重大项目(No.KJ2020ZD49);蚌埠医学院“512人才培育计划”项目(No.by51201103);蚌埠医学院科研创新团队项目(No.BYKC201902);

文章来源:吴凡,李雅,刘星月,等.IL-9抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长及其作用机制[J].华中科技大学学报(医学版),2024,53(04):438-443.