胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是成年人常见的侵袭性较高的颅内原发性恶性肿瘤[1]。GBM标准诊疗方案是尽可能完整手术切除，术后进行放化疗联合电场治疗[2],但即使进行积极的综合治疗，GBM患者中位生存期也仅为22个月[3]。许多新的GBM免疫疗法，包括疫苗、嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗和免疫检查点阻断疗法处于临床试验阶段，存在给药途径障碍、耐药性及全身不良反应等局限性[4-5]。研究[6]发现，GBM组织中存在巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)相关抗原，CMV和GBM间的相关性以及CMV免疫逃避机制已成为研究热点，尤其是巨噬细胞在CMV参与GBM病程进展中的免疫机制。近年来单细胞转录组测序已逐渐应用于实体肿瘤的研究，为寻找GBM潜在的治疗靶点提供了新思路。本研究采用单细胞转录组测序技术分析CMV感染的GBM组织转录组图谱，探讨CMV感染与GBM免疫微环境的关系，报道如下。

1、资料与方法

.1 一般资料

2022年12月—2023年8月新疆医科大学第二附属医院诊治GBM患者20例，男12例，女8例；年龄(49.12±10.81)岁。纳入标准：(1)行手术治疗，术后组织病理检查结合WHO神经系统肿瘤分类标准确诊为GBM;(2)未行放疗、化疗、免疫治疗。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)有自身免疫性疾病者；(3)有严重肝、肾疾病者；(4)3个月内有输血史、使用免疫抑制剂及糖皮质激素者。本研究经新疆医科大学第二附属医院伦理委员会批准通过(伦理批准号：2022H021),患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 胶体金免疫电镜技术

取患者手术切除的GBM组织，4 ℃免疫电镜固定液固定，预冷PBS(pH 7.4)清洗组织块3次，LR白色树脂包埋，制备超薄切片(70～80 nm),放置于镍网上。滴加抗CMV-IE1/2(英国Abcam公司)、抗人CMV-pp65(北京博奥森生物技术有限公司)一抗，4 ℃孵育12 h; 滴加山羊抗小鼠IgG (HL)-4 nm金(美国Jackson ImmunoResearch公司)、山羊抗兔IgG (HL)-10 nm金(美国Sigma公司)二抗，室温孵育2 h, 预冷PBS或TBS冲洗5 min×3次；质量分数2%尿酸铅染色5 min, PBS冲洗；质量分数0.4%柠檬酸铅染色5 min, PBS冲洗；室温下将镍网自然干燥。应用JEM-2000EX透射电镜(日本JEOL公司)观察并拍照，4/10 nm黑色金电子颗粒即为CMV阳性。

1.2.2 微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)

取患者GBM组织，研磨，12 000×g离心10 min, 取上清液，应用microDROP-100A样本制备仪(上海宝予德科学仪器有限公司)制成微滴，将45～55 μL液滴转移至96孔PCR板，30 min内应用microDROP-100B生物芯片分析仪(上海宝予德科学仪器有限公司)进行PCR扩增，采用Quant Drop软件分析结果。比较CMV阳性与阴性GBM组织病毒拷贝数。

1.2.3 单细胞转录组测序

取经胶体金免疫电镜技术及ddPCR证实CMV感染和未感染的GBM组织(CMV阳性6例，CMV阴性3例),使用Chromium单细胞5′试剂盒(10×Genomics)(美国Thermo Fisher公司)制备单细胞转录组测序数据库，严格按照说明书进行操作。应用HiSeq×10单细胞测序平台(美国Illumina公司)对样本进行测序。采用Cell Ranger软件(V7.0.0)对PE150 Illumina测序读数进行预处理：首先将原始格式读数转换为FASTQ格式，将FASTQ格式读数与人类基因组参考(hg38、GRCh38)进行比对，再生成每个样本的基因表达矩阵。过滤低质量的细胞数据，包括基因数目过少、基因数目过多、线粒体基因比例过高。然后采用Seurat V4软件进行降维和聚类，应用NormalizeData和ScaleData函数对所有基因表达进行标准化和缩放，并使用Find Variable Feautres函数选择前2 000个可变基因进行主成分分析。选取前20个主成分，使用FindClusters函数将细胞分成多个簇。采用Harmony R软件消除样本间批次效应。采用统一流形逼近与投影(Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP)算法在二维空间中可视化细胞。采用InferCNV软件检测单细胞转录组测序数据中染色体数目变异情况。采用R软件GSVA工具包进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA),筛选CMV阳性与阴性GBM组织CD68+SOX2+肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)间的差异表达基因。采用R软件clusterProfiler工具包进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析，P<0.05为显著富集。

1.2.4 SOX2+CD68+TAM鉴定

取经胶体金免疫电镜技术及ddPCR证实的6例CMV阳性和3例CMV阴性GBM组织，用Hanks平衡盐溶液洗涤标本3次，加入3 mL sCelLive组织解离液，37 ℃解离15 min; 无菌过滤器收集细胞悬液，按1：2加入GEXSCOPE红细胞裂解缓冲液，室温孵育5 min以去除红细胞；4 ℃、300×g离心5 min去除上清液，沉淀用PBS重悬，制成单细胞悬液。应用Zombie NIR Fixable Viability Dye Kit(美国BioLegend公司)在25 ℃下避光染色20 min, 含体积分数2%胎牛血清的PBS清洗；加入Alexa Fluor 647抗人CD68抗体(美国BioLegend公司),25 ℃避光孵育60 min, 含体积分数2%胎牛血清的PBS清洗；应用FIX&PERM细胞透化试剂盒(美国Thermo Fisher公司)固定和透化细胞；Alexa Fluor 488抗SOX2抗体(美国BioLegend公司)孵育，含体积分数2%胎牛血清的PBS清洗，1×稳定固定剂重悬。以外周血单核细胞悬液作为对照，应用FACS CantoⅡ型流式细胞仪(美国BD公司)检测CD68、SOX2水平，比较CMV阳性与阴性GBM组织CD68+SOX2+TAM百分比。

1.2.5 免疫荧光染色

取6例CMV阳性和3例CMV阴性GBM组织，甲醛固定，石蜡包埋，切片(厚度4～5 μm);二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，柠檬酸缓冲液(pH 6.0)微波抗原修复；滴加含体积分数10%山羊血清的PBS,37 ℃孵育30 min以阻断非特异性抗原；滴加抗CD68(1：200)(美国Thermo Fisher公司)、SOX2(1：200)(英国Abcam公司),4 ℃孵育过夜，含体积分数0.1% Tween-20的PBS冲洗；滴加HRP标记IgG二抗(1：200),37 ℃孵育1 h; 滴加酪酰胺信号放大试剂，室温孵育10 min以增强荧光信号；滴加DAPI染液(1：1 000),室温避光孵育10 min, 蒸馏水冲洗；滴加抗荧光淬灭封片剂封片。应用Mantra系统及CaseViewer软件在荧光激发光谱(420～720 nm)范围内扫描切片，获取多光谱图像，应用DP72/IX71荧光显微镜(日本Olympus公司)观察。

1.3 统计学处理

应用GraphPad Prism 9.5和R 4.2.2软件进行统计分析，以校正后P<0.05且|log2FC|≥2筛选差异表达基因；正态分布计量资料以均数±标准差

表示，2组比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 GBM组织感染CMV情况

胶体金免疫电镜结果显示，CMV阳性GBM组织存在稀少的金标记电子致密颗粒，与CMV颗粒形态一致。ddPCR结果显示，20例患者中12例(60%)GBM组织存在低水平病毒拷贝数即CMV阳性，余8例为CMV阴性。CMV阳性GBM组织病毒拷贝数[(150±30)copies/mL]高于CMV阴性GBM组织[(10±5)copies/mL](t=7.200,P<0.001)。见图1-2。

图1 CMV阳性与阴性GBM组织病理图(HE染色)

图2 CMV阳性GBM组织透射电镜图

2.2 GBM组织单细胞转录组测序结果

单细胞转录组测序获得6例CMV阳性和3例CMV阴性GBM组织共121 637个GBM细胞的转录组数据，成功鉴定出CMV阳性和阴性GBM组织中均存在肿瘤细胞、巨噬细胞、少突胶质细胞、内皮细胞、基质细胞、T淋巴细胞6种主要细胞类型，以及1种新的免疫细胞亚群即共表达巨噬细胞标志物CD68和肿瘤细胞标志物SOX2的双阳性TAM(CD68+SOX2+TAM)(图3-5)。MGMT基因启动子甲基化和TP53基因突变状态下CD68+SOX2+TAM较集中(图6-7),排除这些因素影响后，CD68和SOX2在CD68+SOX2+TAM中表达显著升高(图8)。CMV阳性GBM组织中GBM细胞存在7号染色体扩增和10号染色体缺失(图9)。

图3 不同类型细胞分布及CMV感染状态的UMAP分析图

图4不同类型细胞标记基因表达的点图

图5不同临床及分子特征患者GBM组织各类型细胞比例的条图

图6MGMT基因启动子甲基化状态的UMAP分析图

图7TP53基因突变状态的UMAP分析图

图8不同基因表达的UMAP分析图

图9染色体拷贝数变异分析图

2.3 CD68+SOX2+TAM检测及功能分析结果

免疫荧光染色结果显示，CMV阳性GBM组织中CD68和SOX2共表达，CMV阴性GBM组织中CD68和SOX2共表达不明显(图10)。流式细胞术分析结果显示，CD68+SOX2+TAM在CMV阳性GBM组织中富集；CMV阳性GBM组织CD68+SOX2+TAM百分比[(4.86±0.25)%]高于CMV阴性GBM组织[(0.94±0.41)%](t=8.160,P<0.001)(图11)。功能分析结果显示，CMV阳性和阴性GBM组织CD68+SOX2+TAM的差异表达基因主要与CMV感染有关，涉及病毒蛋白与细胞因子及其受体相互作用的信号通路(图12-13)。

图10CMV阳性和阴性GBM组织免疫荧光染色图

图11CMV阳性和阴性GBM组织CD68+SOX2+TAM流式细胞图

图12CMV阳性和阴性GBM组织CD68+SOX2+TAM差异表达基因GSEA图

注:GSEA用于分析某个基因集的基因在与表型相关度排序中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献。横轴表示根据表型相关度排序后的基因集，图中间的黑色竖条表示单个基因在排序中的位置。虚线左侧红色区域覆盖的黑色竖条表示与CMV感染表型呈正相关的基因集，这些基因高表达与表型发生有关。虚线右侧紫色区域覆盖的黑色竖条表示与CMV感染表型呈负相关的基因集，这些基因低表达或抑制与表型发生有关。图顶部显示富集得分曲线，曲线峰值前端显示CMV感染相关基因。粉色区域表示富集得分为正的区域(即富集区域),紫色区域表示富集得分为负的区域。

图13CMV阳性和阴性GBM组织CD68+SOX2+TAM差异表达基因KEGG通路富集分析图

3、讨论

GBM是侵袭性较强的颅内原发恶性肿瘤，常规治疗方案不能明显改善患者中位生存率[1-2,6]。目前针对GBM的新型免疫治疗方法如疫苗、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗和免疫检查点阻断疗法仍在实验阶段，且GBM对这些治疗方法普遍存在低反应性，疗效不佳[4-5]。因此，迫切需开发免疫治疗的新靶点来改善GBM患者预后。

CMV是双链DNA病毒，属于β-疱疹类病毒，其基因组大小约235 kb, 具有严格的宿主特异性，在人体可建立终生持久性感染[7-9]。Cobbs等[10]于2002年首次报道在GBM组织中检测到人类CMV抗原，目前已有研究[11]证实胶质瘤患者脑组织和血液中均可检测到CMV基因序列及CMV相关抗原、抗体。有研究[12-14]发现，CMV可下调血小板反应蛋白-1、纤维酸性蛋白、连接蛋白表达，或通过激活血小板衍生生长因子受体α进而激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路等方式，抑制GBM细胞凋亡、自噬，促进GBM细胞增殖、肿瘤新生血管生成，进而增强肿瘤免疫逃逸和侵袭能力。本研究采用胶体金免疫电镜和ddPCR技术检测GBM组织，结果发现20例患者中12例CMV阳性，CMV阳性GBM组织病毒拷贝数高于CMV阴性GBM组织，提示CMV感染可能与GBM发生有关。但目前CMV是否为导致GBM的病原体尚无定论，需进一步深入研究。

单细胞转录组测序技术是在单个细胞水平对基因组、转录组和表观组等进行高通量测序分析，弥补了传统测序易丢失细胞异质性的不足[15]。近年来单细胞转录组测序技术在实体肿瘤研究中的应用越来越广泛。因此，采用单细胞转录组测序技术探究GBM免疫抑制机制可为开发更有效的免疫治疗策略提供依据。本研究通过单细胞转录组测序绘制了CMV感染GBM组织的细胞图谱，鉴定出CMV阳性和阴性GBM组织中存在1种新的免疫细胞亚群即共表达巨噬细胞标志物CD68和肿瘤细胞标志物SOX2的双阳性TAM(CD68+SOX2+TAM)。TAM是肿瘤浸润免疫细胞中的重要亚群之一，通过调控肿瘤细胞代谢，增强糖酵解，促进细胞增殖，进而促进GBM恶性进展[16]。此外，TAM还大量分泌pleiotrophin蛋白，该蛋白与GBM中肿瘤干细胞膜表面的蛋白酪氨酸磷酸酶受体Z1型受体结合，激活一系列信号通路，维持肿瘤干细胞的恶性生物学行为并促进肿瘤生长[17]。双阳性TAM已在多种恶性肿瘤中被证实，目前已发现GBM、黑色素瘤、结肠腺癌和卵巢癌中均存在双阳性TAM[18-20]。有研究[21]显示，巨噬细胞吞噬融合胶质母细胞瘤细胞是形成双阳性TAM的主要机制，与正常TAM相比，GBM中双阳性TAM表现出更高的免疫抑制活性和更强的吞噬作用，有助于肿瘤侵袭、转移和进展。

本研究免疫荧光染色结果显示，CMV阳性GBM组织中CD68和SOX2共表达，CMV阴性GBM组织中CD68和SOX2共表达不明显；流式细胞术分析结果显示，CD68+SOX2+TAM在CMV阳性GBM组织中富集，CMV阳性GBM组织CD68+SOX2+TAM百分比高于CMV阴性GBM组织。以上结果进一步证实了GBM阳性组织中存在CD68+SOX2+TAM富集，提示CMV感染可导致CD68+SOX2+TAM产生增多进而重塑GBM免疫微环境。TAM可分为M1型和M2型2种，M1型TAM表达促炎因子，有较强的杀伤肿瘤细胞的能力，可激活其他免疫细胞，参与抗肿瘤免疫反应；而M2型TAM表达抗炎因子，促进肿瘤细胞存活、增殖和转移，可抑制其他免疫细胞功能，参与免疫抑制反应。GBM免疫微环境中M2型TAM占主导地位，但同时也存在M1型TAM,二者共同参与免疫抑制和免疫应答的双重作用[22]。尤其是M2型TAM可能通过激活信号转导及转录激活因子3信号通路及调控PD-L1/PD-1信号通路，从而影响GBM免疫微环境[23]。本研究结果提示，CMV感染可能促进GBM的发生，CMV感染的GBM组织中CD68+SOX2+TAM比例较高，故推测CD68+SOX2+TAM属于M2型TAM,在GBM免疫微环境中发挥促进肿瘤细胞恶性生物学行为的重要作用。

目前缺乏CMV与TAM间相关性的研究。本研究功能分析结果显示，CMV阳性和阴性GBM组织CD68+SOX2+TAM的差异表达基因主要与CMV感染有关，涉及病毒蛋白与细胞因子及其受体相互作用的信号通路。提示CD68+SOX2+TAM的产生与CMV感染后病毒蛋白与细胞因子及其受体相互作用有关，可能导致GBM免疫抑制。但CMV、CD68+SOX2+TAM与GBM发生、发展的关系仍需进一步探究。

本研究结果提示，GBM患者可能存在CMV感染，CMV感染可诱导共表达巨噬细胞和肿瘤细胞标志物的双阳性TAM(CD68+SOX2+TAM)产生从而重塑GBM免疫微环境。本研究初步阐述了CMV、GBM、CD68+SOX2+TAM三者间的联系，为理解GBM的免疫机制提供了重要见解，为开发GBM的免疫治疗方法提供了潜在靶点。但本研究收集的GBM组织样本有限，需更多样本验证；本研究未直接证实CD68+SOX2+TAM与GBM临床进展的关联，尚需后续基础和临床研究进一步探究。

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基金资助:自治区科技支疆计划项目(2022E02135);

文章来源:薛箕山,阿衣希塔·奴尔江,邱浩,等.巨细胞病毒感染与胶质母细胞瘤免疫微环境的关系[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(10):997-1005.