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尿液游离DNA检测及其在肿瘤诊治中应用的研究进展

2021-06-04 286 上传者：管理员

摘要：尿液中的游离DNA来源于尿道脱落细胞的崩解和通过尿道过滤屏障的血液循环cfDNA。作为液体活检的重要对象，尿中游离DNA可能成为一种新型的标记物用于肿瘤无创筛查与诊断、病情监测和疗效评估。本文将对尿液游离DNA的提取与检测方法及其在多种肿瘤的临床应用等方面的研究进展进行总结综述。

关键词：
尿液
提取与检测
标记物
游离DNA
肿瘤
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游离DNA(cfDNA)又称循环DNA,存在于健康个体和疾病患者体内[1]。作为液体活检的重要对象，cfDNA检测具有微创和时效性强的特点，可为肿瘤早期诊断、病情监测、疗效评估及个体化治疗等方面提供重要信息[2]。尿液cfDNA(ucfDNA)含有肿瘤组织的DNA特征，因此尿液cfDNA有望成为一种新型的肿瘤检测标记。本文就尿液cfDNA的提取与检测以及在肿瘤的筛查与诊断、病情监测和疗效评估等方面的研究进展进行了综述。

1、尿液cfDNA概述

1.1尿液cfDNA的来源及生物特征

尿液cfDNA的来源包括尿道脱落细胞的崩解和通过尿道过滤屏障的循环cfDNA两种，后者又称为肾外DNA[3]201-209。尿液cfDNA根据长度可分为两种：大片段DNA和小片段DNA[4]。大片段DNA通常长度超过1kb,主要来源于尿道脱落细胞和(或)尿液中白细胞的坏死[5]。小片段DNA则来源于血液循环DNA和(或)尿液中细胞的凋亡[6,7]。患泌尿系统疾病(如肿瘤)时，由于病灶直接与尿液接触，病变细胞易被释放到尿液中，因此对尿液中cfDNA检测分析可以一定程度上反映泌尿系统的疾病状态[8,9]。在2000年，BOTEZATU等[10]首次确证了肾外DNA的存在，并提出其具备穿越肾滤过屏障的能力。文献表明[3]211-221孕妇尿液中可检测到胎儿cfDNA从而用于产前诊断，进一步证实血液循环cfDNA可穿过肾滤过屏障进入尿液。FUJII等[11]研究发现，在黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌等多种非泌尿系统肿瘤患者尿液中可检测到肾外DNA,经证实为循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)。

1.2尿液cfDNA提取和检测

生理情况下，人体肝脏和肾脏的网状内皮系统会清除大部分衰老、死亡的细胞和组织中碎片，少量未被清除的细胞中的DNA片段通过毛细血管壁或淋巴管管壁渗透到血液循环，进而进入体液中，因此健康人的尿液cfDNA浓度很低，而肿瘤组织代谢速度快，坏死和凋亡细胞数量增加，加之肿瘤患者的免疫功能紊乱，网状内皮系统的清除作用减弱，cfDNA浓度相对较高[1]。如何从尿液中分离、提取高质量的cfDNA,是研究尿液cfDNA在肿瘤中应用(特别是非泌尿系统肿瘤)的重要前提。目前主要是采用商品化的试剂盒(如磁珠吸附法、微柱吸附法等)进行尿液cfDNA的分离提取。对cfDNA的检测对象多为肿瘤相关基因，如鼠类肉瘤病毒癌基因(kirstenratsarcomaviraloncogene,KRAS)、TP53和磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol3-kinasecatalyticsubunitalpha,PIK3CA)和人成纤维细胞生长因子受体-3(fibroblastgrowthfactorreceptor-3,FGFR3)等基因，常用的技术有Real-PCR、甲基化特异性PCR和如微滴式数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)和NGS。NGS是检测尿液cfDNA的主流技术，可分析尿液cfDNA中出现的拷贝数改变和(或)DNA突变，从而了解肿瘤患者的基因组信息变化，为后续的临床应用及个体化治疗提供信息[11,12]。

2、尿液cfDNA在肿瘤中的临床应用

2.1肿瘤的检测和诊断

泌尿系统肿瘤，由于病灶直接与尿液接触，因此对尿液中cfDNA检测分析可以用于泌尿系统肿瘤的诊断。BRISUDA等[13]研究了66例膀胱癌患者和34例健康对照个体的尿液cfDNA,发现观察组cfDNA水平显著高于对照组，并提出尿液cfDNA水平具有诊断膀胱癌的潜在价值。KIM等[14]研究发现，膀胱癌患者的尿液拓扑异构酶ⅡA(TopoⅡA)cfDNA水平显著高于健康对照个体和血尿患者，而且肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasivebladdercancer,MIBC)患者尿液中拓扑异构酶ⅡAcfDNA浓度显著高于非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasivebladdercancer,NMIBC)患者。相对于凋亡产生的碎片化DNA,肿瘤坏死细胞则释放较长的DNA片段。因此，对尿液cfDNA片段长度的检测一定程度可以辅助诊断泌尿系统肿瘤。CASADIO等[15]采用Real-PCR技术检测了尿液cfDNA中大于250bp的基因(如c-Myc),实验对象有膀胱癌患者、有临床症状患者和健康对照个体。借助接受者操作特性曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)分析发现，在最佳判断值0.1ng/μL健康对照和有临床症状组的特异性分别是0.84和0.83,提出尿液cfDNA完整性分析是诊断早期膀胱癌的灵敏和特异性指标。CASADIO等[16]另一项对前列腺癌的研究也得到了类似的结果。尿液cfDNA的微卫星改变亦是检测和诊断肿瘤的重要标记。SAIDI等[17]分析了70例膀胱移行细胞癌患者的GSN和D18S51位点，发现有46例检测到微卫星不稳定(microsatelliteinstability,MSI)和(或)杂合性丢失(lossofheterozygosity,LOH),提出微卫星改变在膀胱癌诊断方面具有潜在应用价值。YAN等[18]采用双基因表达率方法，分别研究了前列腺癌和前列腺增生患者尿液cfDNA的TSPAN13和S100A9基因表达情况，发现前者较后者显著增高，提出尿液cfDNA是理想的前列腺癌诊断指标。谷胱甘肽S-转移酶P1基因(glutathioneS-transferaseP1,GSTP1)启动子区超甲基化是前列腺癌最常见的DNA异常改变。HALUSKOVA等[19]采用甲基化荧光定量PCR技术对前列腺癌患者尿液cfDNA的GSTP1启动子区域检测，发现5例患者中有3例出现高甲基化状态，提出对尿液cfDNA的GSTP1甲基化状态在诊断前列腺癌中具有潜在价值。

循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTC)与肿瘤血行转移密切相关。由于肿瘤细胞生存的微环境改变、血流剪切力及外周血中免疫细胞的作用，绝大多数CTC发生凋亡，产生的肿瘤细胞DNA片段通过肾滤过屏障后组成肾外DNA的一部分。研究表明[20],非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者尿液中可检测到KRAS突变。除了检测KARS突变，尿液cfDNA中表观遗传学改变也被用于肿瘤检测。SONG等[21]评估了尿液波形蛋白基因超甲基化(hypermethylatedvimentingene,mVIM)在结肠癌中临床诊断价值，结果表明75%的结肠癌患者检出mVIM,提出尿液中的表观遗传学改变也可能用于诊断结肠癌。研究表明[22],在肝癌患者尿液cfDNA可检测到TP53基因G249T突变，提示尿液cfDNA可能在肝癌诊断方面具有潜在价值。GUERRERO等[23]研究发现，宫颈癌患者尿液cfDNA中可检出人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)DNA,提出尿液cfDNA中检测HPV有望成为宫颈癌细胞学检查的补充手段。

2.2肿瘤进展期监测

肿瘤进展期监测在病情评估、早期转移诊断及个体化治疗方面都具有重要价值。BIRKENKAMP等[24]对NMIBC的回顾性研究发现，在疾病早期和晚期阶段，患者尿液cfDNA中都可检测到一定水平的突变DNA。在早期阶段，患者尿液cfDNA可检测到高水平的突变DNA,而在晚期阶段则不明显，提示检测尿液cfDNA中的遗传变异水平一定程度可以用于NMIBC的进展期监测。CHRISTENSEN等[25]采用ddPCR技术对膀胱癌患者尿液cfDNA中的FGFR3和PIK3CA突变水平进行了监测，发现FGFR3和PIK3CA的突变水平与膀胱癌的进展密切相关。LI等[26]通过对不同病程NSCLC患者尿液cfDNA的动态监测发现，cfDNA水平受治疗方法影响，呈现较强相关性，提出对尿液cfDNA动态监测可能用于NSCLC进展期监测。WANG等[27]检测了NSCLC患者尿液cfDNA中KRAS突变，发现尿液KRAS突变类型和原发组织活检整体一致率为95%。通过对患者尿液纵向监测，发现cfDNA水平与癌症进展密切相关。

2.3治疗效果监测

液体活检是一种针对患者体内循环系统的非侵入性病理检测方法，与传统的肿瘤活检相比具有微创性、成本低和可重复取样等显著优势，在肿瘤研究中应用广泛[28]。XIA等[29]首次采用全基因组测序技术检测了晚期前列腺癌患者治疗前后尿液cfDNA拷贝数变异情况，发现34个基因座出现拷贝数的显著性改变，并且依据变化差异最显著的10个基因座，提出一种用于评估尿液cfDNA拷贝数改变的评分算法，用于监测疗效及评估总生存率。CHEN等[30]对NSCLC患者在接受酪氨酸酶抑制剂治疗期间尿液cfDNA中EGFR突变情况进行了动态监测，发现其与治疗效果密切相关。其它关于NSCLC的研究也得到了类似的结果[31,32]。SHI等[33]对原发性胃癌患者在接受酪氨酸激酶抑制剂治疗期间尿液cfDNA中的EGFR突变情况进行动态监测，发现其与胃癌患者的疾病状况直接相关。FUJII等[11]通过NGS技术对尿液cfDNA中的KRASG12/G13拷贝数进行了定量检测，结果表明当患者接受治疗时，尿液中cfDNA的KRASG12/G13拷贝数显著少于肿瘤基线和进展期，提示尿液中cfDNA的KRASG12/G13拷贝数变化可能与治疗效果密切相关。

3、小结与展望

尽管关于尿液cfDNA在肿瘤中的临床应用的研究数量有限，但尿液cfDNA分析作为一种非侵入性检查手段，在肿瘤遗传信息分析方面具有独特优势，有望成为肿瘤诊断、进展监测和疗效评估的补充方法。随着分子生物检测技术的不断更新，特别是尿液cfDNA的提取与纯化及DNA分型技术的进步，尿液cfDNA在临床肿瘤研究与应用中的潜在价值会逐渐显现。

参考文献：

[1]李禹龙,贺建勋,曾小莉,等.血浆游离DNA检测临床意义的研究进展[J].中华检验医学杂志,2019,42(4):318-322.

[28]杨凌舸,罗鹏,陈士奇,等.液体活检技术在肿瘤中的研究与应用进展[J].肿瘤,2018,38(11):96-102.

文章来源：徐冬冬,黄花.尿液游离DNA检测及其在肿瘤诊治中应用的研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(13):2347-2350.

基金：四川省基层卫生事业发展研究中心(编号:SWFZ16-Z-46)