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骨髓瘤原代细胞斑马鱼模型的建立及在药物筛选中的应用

2023-11-21 165 上传者：管理员

摘要：目的：应用斑马鱼建立多发性骨髓瘤（MM）患者原代肿瘤细胞来源的人源肿瘤异种移植模型（MMPDX），利用该模型对候选药物靛玉红-3′-单肟（I3MO）的抗骨髓瘤活性进行药效学评价。方法：取受精后2 d的斑马鱼胚胎进行荧光标记的MM患者原代肿瘤细胞移植，细胞注射后0、16和24 h，观察MM患者原代肿瘤细胞在斑马鱼体内生存，将肿瘤细胞移植后的斑马鱼胚胎随机分为对照、BTZ治疗、I3MO治疗共3组，在药物BTZ、I3MO处理前和处理24 h后，通过荧光显微镜观察斑马鱼体内荧光区域面积反映MM患者原代肿瘤细胞存活情况并验证。结果：MM患者原代肿瘤细胞可在斑马鱼体内存活，MM-PDX构建成功。与对照组相比，BTZ和I3MO药物干预后斑马鱼体内荧光区域的面积均显著降低（P<0.05）,BTZ、I3MO显著抑制MM细胞在斑马鱼体内的生存。结论：成功建立了原代MM患者肿瘤细胞来源的斑马鱼模型MM-PDX，应用此模型可作为抗MM药物筛选的工具。

关键词：
人源肿瘤异种移植
多发性骨髓瘤
斑马鱼
硼替佐米
靛玉红-3′-单肟
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个体化精准治疗，是多发性骨髓瘤（MM）患者理想的治疗模式。MM的治疗药物众多，如何为患者制定精准化治疗方案，提高治疗的针对性，是实现个体化治疗的重要前提。既往研究表明，应用基因表达谱和基因组学的数据预测患者个体对药物的治疗反应并不准确[1]，体外细胞实验的药效评价结果，与患者的体内药效还存在很多不一致性。因此，MM疾病动物模型的建立和应用将有助于探索个体化精准治疗。文献报道，MM患者原代肿瘤细胞在小鼠体内模型中难以存活[2]。虽然通过移植人类胎儿的骨片可支持肿瘤细胞在小鼠体内的生长，但该小鼠模型的成瘤率较低，且建模周期长达2个月[2,3]。这些技术缺陷促使我们构建一种新的移植瘤动物模型，支持MM肿瘤细胞在动物体内快速且稳定的存活及生长，同时可以有效地评估患者个体对药物的反应。

自20世纪80年代美国俄勒冈大学Streisinger首次使用斑马鱼（Danio rerio）作为模式生物以来[4]，多种斑马鱼血液疾病模型构建成功，并应用于血液系统肿瘤发病机制的研究和药物筛选及个性化精准治疗的探索[5]。目前已成功构建的血液病斑马鱼模型包括急性T淋巴细胞白血病[6]、急性B淋巴细胞白血病[7]、急性髓系白血病[8]和骨髓增生异常综合征[9,10]等。2016年，哈佛大学的研究团队在国际上首次报道了MM细胞系和MM患者原代肿瘤细胞来源的斑马鱼模型的建立及其应用。随后，Colombo等[11]应用该模型替代小鼠移植瘤模型评价了Jagged1/2基因在MM细胞中对蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ）敏感性的影响。但MM斑马鱼模型的建立及应用在国内尚少见。

本研究建立了MM患者原代肿瘤细胞的斑马鱼模型（multiple myeloma-patient derived xenograft,MM-PDX），并应用该模型评估候选治疗药物对MM原代细胞的杀伤效果，为研究MM患者个性化治疗方案提供了新的动物模型。

一、材料和方法

实验动物

斑马鱼胚胎（野生型AB品系）购自国家水生生物种质资源库国家斑马鱼资源中心。斑马鱼饲养在斑马鱼养殖繁育专门设备中，养殖设备资产编号TY2019000259。斑马鱼胚胎通过体外受精获得，并在28℃的培养箱中（E3培养基）孵化。所有斑马鱼研究工作均获得中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）实验血液学国家重点实验室、国家血液病临床研究中心伦理审查委员会的批准，伦理批号（NSFC2021057-EC-1）。

MM患者CD138+肿瘤细胞

8例初诊MM患者均为2020年2月至2021年2月中国医学科学院血液病医院收治的病例，男、女各4例。

试剂和仪器

BTZ购自美国Selleck公司，靛玉红-3′-单肟（indirubin-3’-monoxime,I3MO）购自美国MCE公司，荧光显微镜为德国莱卡公司产品。

MM患者肿瘤细胞来源斑马鱼模型的建立

采集MM初诊患者骨髓样本，应用免疫磁珠分离纯化获得CD138+肿瘤细胞，经0.1μmol/L钙黄绿素（Calcein）或细胞膜红色荧光探针（Dil）进行荧光标记，室温孵育30 min。收集受精后2 d的斑马鱼胚胎，将荧光标记的CD138+肿瘤细胞（100-200个）注入斑马鱼胚胎的卵黄囊间隙。将植入肿瘤细胞的斑马鱼胚胎转移到24孔板中，置于28℃、E3培养基中培养。分别在注射肿瘤细胞时，以及注射后16h、24 h应用荧光显微镜（Leica,M205）观察并定量荧光区域面积，检测MM患者肿瘤细胞在斑马鱼体内的生存情况，以评价斑马鱼模型是否构建成功[12]。

药物处理及药效学评价

将荧光标记CD138+肿瘤细胞注射后的斑马鱼胚胎进行随机分组，分为对照组、BTZ治疗组和I3MO治疗组。应用荧光显微镜观察斑马鱼胚胎体内荧光面积并拍照记录（0 hpt）。随后对照组斑马鱼培养液中加入DMSO(1∶1 000），药物处理组分别对应加入BTZ(10 nmol/L）和I3MO(10μmol/L），药物作用后24 h，通过荧光显微镜观察斑马鱼胚胎体内荧光面积（24 hpt），并分别计算药物处理前后钙黄绿素（绿色）或红色荧光的阳性区域的面积。药物敏感评价的流程见图1。组间比较采用非配对t检验（n≥8个胚胎）。

统计学分析

数据处理和制图采用GraphPad Prism软件（version8.01,GraphPad software Inc．）。统计学分析采用不配对样本的t检验。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。P<0.05示差异有统计学意义。

二、结果

MM患者肿瘤细胞来源斑马鱼模型的成功建立

将荧光标记的MM肿瘤细胞注入斑马鱼卵黄囊腔内后0、16和24 h用荧光显微镜观察并定量阳性区域荧光面积，结果显示，与注射0 h相比，注射后16和24 h的斑马鱼体内的荧光面积没有显著变化（图2），表明MM肿瘤细胞可在斑马鱼体内良好存活，MM患者原代肿瘤细胞来源的斑马鱼模型MM-PDX成功构建。MM细胞注射40-48 h后，斑马鱼胚胎陆续开始出现死亡，且体内荧光面积和强度随时间延长逐渐衰减。表明16-24 h是观察斑马鱼胚胎荧光阳性区域变化的较好时间。

利用MM肿瘤细胞斑马鱼模型验证I3MO对MM细胞的杀伤作用

患者1的CD138+肿瘤细胞注射入斑马鱼体内，经BTZ 10 nmol/L或I3MO 10μmol/L处理24 h (24hpt）。与处理前相比，BTZ和I3MO处理组荧光阳性区域面积显著降低[（0.00086±0.00049)vs(0.00133±0.00032) mm2,P<0.05;(0.00063±0.00052)vs(0.00182±0.00045)mm2,P<0.001）]。表明，10 nmol/L BTZ和10μmol/L I3MO均可显著抑制MM肿瘤细胞在斑马鱼体内的生存（图3）。

为了进一步验证应用斑马鱼模型进行药物筛选的有效性和灵敏度，将患者2的CD138+细胞注射入斑马鱼卵黄囊腔内，并应用BTZ和I3MO药物浓度梯度处理（图4）。结果显示，随药物浓度增加荧光阳性区域面积降低。表明，应用斑马鱼模型可监测到BTZ(r=0.999）或I3MO(r=0.909）对MM细胞杀伤作用的剂量依赖效应（图5）。

三、讨论

应用斑马鱼模型可发现活性化合物和药物靶标，同时可全面评估化合物的毒性和副作用，缩短药物研发周期，是进行高通量药物筛选理想的动物模型[13,14]。MM细胞通常不能在体外存活、增殖，斑马鱼体内分泌IL-6和SDF1α，可以支持MM细胞在其体内的生长[15]。因此，斑马鱼是一个可用于MM药物评价的理想模型。本研究构建了MM患者肿瘤细胞来源的斑马鱼模型，并通过定量分析荧光阳性区域的面积测量肿瘤负荷并进行药物评价。

本研究应用MM患者来源的CD138+肿瘤细胞证明了MM细胞可以在斑马鱼胚胎中存活，红色荧光染料Dil标记的MM细胞被注射入斑马鱼胚胎的卵黄囊内，24 h斑马鱼体内的荧光强度与面积保持稳定，与0 h无明显差异，为进行药效评价实验提供了时间窗口。表明斑马鱼卵黄囊为MM细胞生长提供了有利的微环境支持。

本研究进一步评价了斑马鱼模型能否用于抗MM药物的药效评价。观察了I3MO[16]对斑马鱼体内MM细胞的杀伤作用，并以临床常用抗MM药物BTZ作阳性对照。结果显示，24 h后，对照组红色荧光的面积没有显著变化，而10 nmol/L BTZ和10μmol/L I3MO处理组红色荧光的面积较处理前显著降低。表明MM患者肿瘤细胞来源的斑马鱼模型的建立可用于快速的药效学评价，是MM药物筛选强有力的工具。

本研究设置了药物浓度梯度处理斑马鱼胚胎，以进一步评价斑马鱼模型用于药效评价的敏感性。结果显示，BTZ和I3MO对MM细胞的杀伤作用有浓度依赖效应（r值分别为0.999和0.909），在斑马鱼模型中得以体现，进一步说明了该模型用于药物评价的敏感性和可行性。

本研究报道了MM患者来源斑马鱼模型的成功构建，并应用该模型成功进行了药效评价。该模型仅需使用较小数量（100-200个）的MM患者肿瘤细胞，即可在短时间内评价患者对药物的治疗敏感性，为指导临床用药提供个性化的信息。同时，斑马鱼胚胎变异度较小，药效评价结果重复性好，也是该模型的一大优点。

基金资助:中国医学科学院重大协同创新项目(2021-1-I2M-040);国家自然科学基金(82170194,82370210,81920108006);天津市科学基金(20JCQNJC00310);

文章来源:于珍,李颖,王可飞等.多发性骨髓瘤原代细胞斑马鱼模型的建立及其在药物筛选中的应用[J].中国实验血液学杂志,2023,31(06):1745-1749.