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淋巴瘤患者外周血sPD-1和sPD-L1水平及临床意义

2023-11-21 144 上传者：管理员

摘要：目的：观察淋巴瘤患者外周血可溶性程序性细胞死亡蛋白1(sPD-1)及其配体（sPD-L1）水平，揭示sPD-1和s PD-L1在淋巴瘤中的临床意义。方法：收集64例初诊淋巴瘤患者和30例健康志愿者的外周血标本及临床资料，酶联免疫吸附试验检测外周血中s PD-1和sPD-L1水平，分析其与患者临床特征（包括淋巴瘤病理类型、分期、乳酸脱氢酶水平、T细胞亚群）的关系。结果：淋巴瘤患者外周血sPD-1和sPD-L1水平均显著高于正常人（P<0.05）；霍奇金淋巴瘤与非霍奇金细胞淋巴瘤患者外周血s PD-1和sPD-L1水平无明显差异；不同病理亚型淋巴瘤患者外周血sPD-1水平存在差异，其中T细胞淋巴瘤患者sPD-1水平显著高于B细胞淋巴瘤患者（P=0.001）;Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ期患者s PD-1及sPD-L1水平均显著高于I、II期患者（P<0.05）；乳酸脱氢酶异常增高患者sPD-L1水平显著高于乳酸脱氢酶正常患者（P=0.001），而sPD-1水平无显著差异；T细胞亚群分析结果显示，sPD-L1水平与CD4+T细胞数量呈负相关（r=-0.265）。结论：淋巴瘤患者外周血sPD-1和sPD-L1水平与淋巴瘤的病理类型、Ann Arbor分期、乳酸脱氢酶含量、T细胞亚群相关，在预测淋巴瘤预后方面具有潜在生物标志物价值。

关键词：
免疫研究
可溶性程序性死亡受体1
可溶性程序性死亡配体1
淋巴瘤
肿瘤
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淋巴瘤是一种起源于淋巴结和淋巴组织的恶性肿瘤，以无痛性进行性淋巴结肿大为特征，根据病理学特征主要分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类。2017年版造血及淋巴组织肿瘤WHO分类将其细分为多个亚型[1]。淋巴瘤是一组高度异质性的疾病，不同亚型的淋巴瘤其临床表现、治疗方式和预后有很大的差异。

随着肿瘤与免疫研究的深入，越来越多的学者尝试从免疫学角度对淋巴瘤进行早期诊断和特异性治疗[2]，其中程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1）及其配体（programmed cell death ligand 1,PD-L1）是重要的负性协同刺激分子。PD-1作为受体蛋白，与其配体PD-L1结合后激活PD-1/PD-L1通路，从而抑制T细胞的激活、增殖及细胞因子的分泌，发挥负性调节作用[3]。PD-1蛋白具有两种表达形式，即膜结合型蛋白m PD-1和可溶性蛋白s PD-1[4]。s PD-1亦具有与PD-L1结合的功能，可以通过竞争性结合PD-L1阻断m PD-1与PD-L1的结合，进而阻断PD-1/PD-L1信号通路，解除对T细胞的功能抑制[5,6]。s PD-L1是细胞表面的PD-L1分子被基质金属蛋白酶剪切而成的具有功能的可溶性形式[7]，通过与细胞表面受体（如m PD-1）相互作用而激活PD-1/PD-L1负性调节通路，在T细胞活化、增殖及细胞因子的产生过程中起到抑制作用，对维持免疫耐受具有一定作用[8]。

近年来，通过单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1负性调控通路，免疫治疗为淋巴瘤的治疗提供了新的思路。s PD-1和s PD-L1作为PD-1/PD-L1的可溶性协同刺激分子，在淋巴瘤中发挥什么作用及其临床意义尚不完全清楚。本研究拟通过检测多种淋巴瘤患者和健康人的外周血s PD-1、s PD-L1水平，分析其与淋巴瘤患者的病理分型、分期及实验室检查指标的关系，以期为寻找淋巴瘤新的生物学标志物提供实验依据。

一、资料与方法

研究对象

收集2019年1月至2022年3月于长沙市第四医院血液肿瘤科住院的初诊淋巴瘤患者64例为研究对象，其中霍奇金淋巴瘤5例，弥漫大B细胞淋巴瘤28例，滤泡淋巴瘤6例，边缘区淋巴瘤5例，套细胞淋巴瘤5例，慢性淋巴细胞白血病/小B细胞淋巴瘤7例，T细胞淋巴瘤8例；B细胞淋巴瘤51例，T细胞淋巴瘤8例，霍奇金淋巴瘤5例；Ann Arbor分期Ⅰ-Ⅱ期15例，Ⅲ-Ⅳ期42例。同时选取30例同期体检的健康者为对照组，其中男性17名，女性13名，男女性别比为1.31，中位年龄56(24-78）岁，年龄、性别均与淋巴瘤患者组无统计学差异。本研究由湖南师范大学附属长沙医院伦理委员会批准，所有受检者在参与研究前均通过伦理委员会认证，并签署知情同意书。

试剂与仪器

人PD-1 ELISA和PD-L1 ELISA试剂盒均为美国Thermo Fisher公司产品，酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

标本采集

采用无添加采血管采集外周血2 ml，标本静置凝集30 min后，1 000×g离心10 min，取上清液检测或分装-80℃低温冰箱储存备用。

外周血清中s PD-1水平测定

血清中s PD-1水平采用ELISA方法测定，操作步骤按照人PD-1 ELISA试剂盒说明书进行。简要步骤如下：先用洗液浸泡酶标板15 s×2次，弃去洗液；加入样品或标准品100µl（空白孔只加标准品稀释液作为对照）；加入生物素偶联的PD-1抗体工作液100µl，室温孕育2 h；清洗4次后加入100µl辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，室温孕育1 h；清洗4次，加入100µl显色底物TMB，避光孵育30 min；加入100µl终止液终止反应，并在30min之内使用酶标仪在450 nm波长下测量吸光度值，根据吸光度值计算血清中s PD-1的水平。

外周血清中s PD-L1水平测定

血清中s PD-L1水平采用ELISA方法测定，操作步骤按照人PD-L1 ELISA试剂盒说明书进行。简要步骤如下：洗液浸泡酶标板10 s×2次，弃去洗液；加入样品或标准品100µl，室温孕育2 h；加入生物素偶联的PD-L1抗体工作液100µl，室温孕育1 h；清洗4次后加入100µl辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，室温孕育30 min；清洗4次，加入100µl显色底物TMB，避光孵育30 min；加入100µl终止液终止反应，并在30 min之内使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度值，根据吸光度值计算血清中s PD-L1的水平。

统计学分析

使用Graph Pad Prism 5.0以及SPSS 21.0软件进行数据分析及图表制作。选择双向检验；连续变量资料采用中位数及范围进行描述，两组比较采用MannWhitney U检验，多组比较采用Kruskal-Wallis H检验；数值变量的相关性采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

外周血s PD-1水平与淋巴瘤患者病理特征及实验室检查指标的关系

淋巴瘤患者及健康者血清中均可检测到s PD-1，健康对照组血清s PD-1水平为29.026 15(7.3468-61.4302)pg/ml，淋巴瘤组为64.5054(20.3551-432.4352)pg/ml，淋巴瘤组较健康对照组s PD-1水平显著性增高（P<0.001）（图1A）。进一步比较霍奇金淋巴瘤与非霍奇金淋巴瘤患者血清中s PD-1水平，结果显示差异无统计学意义（P>0.05）（图1B）。B细胞淋巴瘤患者血清中s PD-1水平为63.2354(20.3551-286.4670)pg/ml,T细胞淋巴瘤患者为183.0645(59.3452-432.4352)pg/ml,T细胞淋巴瘤组较B细胞淋巴瘤组患者血清中s PD-1水平显著性增高（P=0.001）（图1C）。进一步根据病理类型比较霍奇金淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小B细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤之间血清s PD-1水平的差异，结果显示，组间s PD-1表达水平存在显著性差异（P<0.001),T细胞淋巴瘤组s PD-1表达水平显著高于其他6组（图1D）。比较不同淋巴瘤分期、乳酸脱氢酶（LDH）水平的淋巴瘤患者外周血s PD-1水平的差异，结果显示，Ann Arbor分期I、II期淋巴瘤患者s PD-1水平为51.9250(21.3918-133.1131)pg/ml,III、IV期淋巴瘤患者为80.4566(23.9451-432.4352)pg/ml,III、IV期淋巴瘤组较I、II期淋巴瘤组患者s PD-1水平显著性增高（P=0.007）（图1E);LDH水平异常增高与LDH水平正常患者s PD-1水平无显著差异（P>0.05）（图1F）。

分析血清中s PD-1水平与T细胞亚群的关系显示，淋巴瘤患者外周血s PD-1水平与CD4+及CD8+T细胞亚群均无明显关系（图2）。

外周血s PD-L1水平与淋巴瘤患者病理特征及实验室检查指标的关系

淋巴瘤患者及健康者血清中均可检测到s PD-L1,健康对照组血清中s PD-L1水平为5.0234(0.3335-8.9562)pg/ml，淋巴瘤组为6.5445(1.1150-33.3576)pg/ml，淋巴瘤组较健康对照组s PD-L1水平显著性增高（P=0.008）（图3A）。霍奇金淋巴瘤与非霍奇金淋巴瘤患者血清中s PD-L1水平比较无显著差异（P>0.05）（图3B）。B细胞淋巴瘤与T细胞淋巴瘤患者血清中s PD-L1水平比较无显著差异（P>0.05）（图3C）。进一步根据病理类型比较霍奇金淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小B细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤之间血清中s PD-L1水平的差异，结果显示，组间s PD-L1的表达水平无显著性差异（P>0.05）（图3D）。比较不同淋巴瘤分期、LDH水平的淋巴瘤患者外周血s PD-L1水平的差异，结果显示，Ann Arbor分期I、II期淋巴瘤患者s PD-L1水平为4.1836(1.2184-21.6959)pg/ml,III、IV期淋巴瘤患者为7.2613(1.4030-33.3576)pg/ml,III、IV期淋巴瘤组较I、II期淋巴瘤组患者s PD-L1水平显著性增高（P=0.031）（图3E）。LDH水平正常组血清中s PD-L1水平为4.2095(1.1150-10.8894)pg/ml,LDH水平异常增高组为7.8155(1.4030-33.3576)pg/ml,LDH水平异常增高组较LDH水平正常组s PD-L1水平显著性增高（P=0.001）（图3F）。

分析血清中s PD-L1水平与T细胞亚群的关系显示，淋巴瘤患者外周血s PD-L1水平与CD4+T细胞亚群呈负相关（r=-0.265,P=0.034），与CD8+T细胞亚群无明显相关性（r=-0.240,P>0.05）（图4）。

三、讨论

近年来，以免疫检查点单克隆抗体为代表的免疫治疗为肿瘤患者带来了新的治疗选择，PD-1/PD-L1抑制剂在许多实体瘤和复发/难治霍奇金淋巴瘤治疗中疗效得以肯定[9,10]。随着越来越多免疫治疗的开展，哪些生物标记物可用来挑选最合适接受免疫治疗的患者，同种疾病为什么有些患者免疫治疗效果好而另一部分患者会出现疾病超进展，这些问题都是转化医学研究者所关注的。本研究通过检测淋巴瘤患者血清中s PD-1及s PD-L1水平，探索分析s PD-1及s PD-L1是否可作为淋巴瘤诊断与预后的一种生物标志物。

本研究结果显示，淋巴瘤患者血清中s PD-1及s PD-L1水平均高于健康对照者。Mortensen等[11]检测了131例淋巴瘤患者和22名健康个体的血清，发现淋巴瘤患者的s PD-1水平高于健康个体。研究发现，初治弥漫大B细胞淋巴瘤患者的血清s PD-L1水平显著高于对照组，血清s PD-L1是弥漫大B细胞淋巴瘤患者对免疫化疗代谢反应的预测因子[12]。以上研究提示淋巴瘤患者存在不同于健康人群的免疫状态。

本研究进一步分析了不同淋巴瘤的病理类型中sPD-1及sPD-L1水平差异，结果显示，sPD-1的表达水平在不同病理亚型间存在显著差异，其中T细胞淋巴瘤患者s PD-1水平显著高于B细胞淋巴瘤患者，这与Qin等[13]和da Silva等[14]的研究结果一致。本研究结果提示，s PD-1在不同恶性血液疾病中的表达可能存在差异，其在淋巴瘤中的意义更加重要。而s PD-L1相反，不同淋巴瘤病理类型间s PD-L1的表达水平差异无统计学意义。进一步研究结果显示，Ann Arbor分期III、IV期淋巴瘤患者血清中s PD-1水平高于I、II期患者，提示s PD-1水平为一种潜在不良预后因子。Vajavaara等[15]研究发现，血清中s PD-1水平是高危弥漫大B细胞淋巴瘤患者的不良预后因子。血清LDH水平为淋巴瘤的一种预后不良因素，本研究结果显示，LDH异常增高患者s PD-L1水平高于LDH正常患者，而s PD-1水平无明显差异。

在机体免疫活动中，T淋巴细胞是细胞免疫的主力军[16]，其功能主要取决于T淋巴细胞总值（CD3+）及其亚群（CD4+、CD8+）的相对组成，CD4+T细胞活化后主要分化为辅助性T细胞（Th),CD8+T细胞活化后主要分化为细胞毒性T细胞。研究发现，s PD-1作为一种单体蛋白，具有与PD-L1结合的功能，可以通过竞争性结合PD-L1阻断m PD-1与PD-L1的结合，进而阻断PD-1/PD-L1信号通路，解除对T细胞的功能抑制[5,6]。研究表明，s PD-1可以增强细胞促炎因子的表达，进而增加辅助性T细胞Th1和Th17的产生[17]。本研究结果显示，淋巴瘤患者外周血s PD-1水平与T细胞亚群（CD4、CD8）均无明显关系，而s PD-L1水平与T细胞亚群（CD4）含量呈负相关关系。研究发现，循环中的PD-L1在多种肿瘤中发挥抑制T细胞功能的作用[18,19,20]，推测可能在淋巴瘤患者体内不止存在PD-1/PD-L1负性共刺激分子通路这一种调节机制，或存在其他调控网络，具体机制仍需进一步探讨。

研究表明，s PD-1和s PD-L1与多种恶性血液病的不良预后相关，包括NK/T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤等，有望成为一种有意义的生物标志物来预测恶性血液病患者的临床反应及预后[21,22]。本研究在分子水平上比较了淋巴瘤患者和健康人群外周血s PD-1和s PD-L1的表达水平，并探讨了不同病理类型、临床特征患者外周血s PD-1和s PD-L1水平的差异，为淋巴瘤中免疫功能异常机制研究提供了实验依据，也为淋巴瘤的免疫治疗提供了潜在的分子生物学标志物。

本研究也存在一些不足，本研究样本量相对较小且来自单中心，可能会存在一定的偏倚；本研究未能进一步探讨s PD-1、s PD-L1在淋巴瘤疗效及预后评估中的价值，该部分研究数据仍在收集中。淋巴瘤作为一组异质性较大的血液系统恶性肿瘤，要明确免疫功能在其疾病发生发展中的具体机制仍需要大量的临床及实验室研究。随着未来对分子机制的进一步明确及多中心大样本研究的进行，s PD-1、s PD-L1有望在淋巴瘤的早期诊断和疗效预测等方面发挥更大作用。

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81500141);湖南省卫生健康委科研项目(202303046746);

文章来源:刘小柳,何平,雷坚等.淋巴瘤患者外周血sPD-1和sPD-L1水平及临床意义[J].中国实验血液学杂志,2023,31(06):1733-1738.