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基于二代测序探索头颈部高级别转化腺样囊性癌分子遗传学特征

2024-02-27 76 上传者：管理员

摘要：目的:探索头颈部高级别转化腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma with high-grade transformation, ACC-HGT)的临床病理及分子遗传学特征。方法:收集自2020年1月～2022年12月上海第九人民医院口腔病理科诊断的5例高级别转化腺样囊性癌患者的临床病理资料，运用显微切割方法获得肿瘤的高级别转化成分以开展二代基因检测，接着利用免疫组织化学技术进一步验证基因突变对蛋白质生成水平的影响。结果:5例患者都是男性，平均年龄为48岁，追踪观察时间4～30个月，有3例仍然存活，2例已经去世，3例发现局部复发，2例出现血行转移至肺、脑。5例肿瘤中，NOTCH1突变在3例中检出，NOTCH1重排在1例中检出，p53突变在1例中检出，PIK3CA突变在2例中检出，PIK3R1突变在1例中检出，PPP2R2A突变在1例中检出，这些基因突变可引起其下游相关蛋白NICD、p53及PI3K信号通路相关蛋白pAKTSer473高表达。结论:ACC-HGT易复发和血行转移，其遗传改变主要发生在NOTCH、PI3K以及p53通路上。

关键词：
Notch1
p53
PI3K
显微切割
腺样囊性癌
高级别转化
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腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)是唾液腺中最具特色的恶性肿瘤，其显著的特征是生长速度缓慢但具有高度侵袭性，极易沿着神经和血管扩散，具有较高的复发和远处转移率[1]。组织病理学上，ACC根据生长方式，分为筛状、管状和实体3种，其中实体型预后最差。随着分子生物学的发展，目前已明确MYB-NFIB基因重排是腺样囊性癌的关键遗传学改变[2,3]。

伴有高级别转化的腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma with high-grade transformation, ACC-HGT)是ACC罕见的特殊病理类型。在高级别转化区域，可以观察到细胞常常排列成弥漫分布的实性细胞巢，细胞异形性显著，增殖活性升高，呈现出分化差的腺癌或未分化癌图像。由于此类患者预后极差而受到了临床医生的关注[4,5]。了解相关遗传学改变对改善其预后，延长生存期至关重要。因此，本研究对我院5例ACC-HGT进行二代基因测序，探索其独特的分子遗传学特征，为其靶向治疗寻找新的思路。

1、对象与方法

1.1 研究对象

收集上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科2020年1月～2022年12月手术后病理明确诊断为ACC的标本261例，根据Seethala等[6]提出的高级别转化病理诊断标准，阅读苏木精-伊红染色切片及免疫组织化学染色切片，选出病理类型为ACC-HGT 5例。据此，对这5例患者的临床资料进行了查阅，并对其进行了后续的追踪回访。本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院医学伦理委员会批准，批准文号SH9H-2023-T367-1。

1.2 方法

对5例ACC患者的石蜡标本进行切片，然后苏木精-伊红染色，在显微镜下标记出高级别转化腺样囊性癌成分，连续切片，在体视显微镜下收集高级别转化成分，进行靶向二代测序(Foundationone平台，USA),对324个基因改变及特定基因重排进行检测。用免疫组织化学染色的方法，检测肿瘤组织中CK7、p63、Ki-67、p53、NICD(D3B8,Cell Signaling Technology Danvers)和pAKTSer473(44-621G, Cell Signaling Technology Danvers)的表达。

2、结果

5例高级别转化患者皆为男性，年龄20～64岁，平均年龄48岁。发生于上颌窦2例，口底2例，腭部1例。肿瘤直径1.9～5.5 cm, 平均4.08 cm。5例肿瘤均有坏死，4例有神经周围侵犯，1例有血管侵犯，3例有淋巴结转移。所有患者均行手术+术后放疗。截止至2022年12月随访时间4～30个月，3例存活，2例分别在术后23个月和25个月死亡。局部复发3例，远处转移2例(表1)。

二代测序结果显示，1例肿瘤(4821)发生MYB-NFIB融合。意义明确(known significance)的基因改变中，3例肿瘤(1954、4816、4805)发生NOTCH1基因改变，且均为多位点的基因突变：在病例1954和4805中，NOTCH1均发生了错义突变和移码突变(1954 V1721G,H2428fs*6;4805 P1731>QLHF MYVA, V2421fs*4);在病例4816中，NOTCH1发生移码突变和缺失突变(T2466fs*11, deletion exons 2-27)。病例4805中NOTCH通路相关基因SPEN还同时发移码突变(T2552fs*31)。4例肿瘤中检测到PI3K/AKT通路相关基因的PIK3CA(4805 E545K,4822 H1047R)、PIK3R1(1954 N564D)和PPP2R2A(4816 S282fs*15)突变。p53突变(R273C)和FGFR2扩增同时在1例(4821)发生，KDM6A移码突变在1例(1954 L1288fs*4)发生。此外，多个意义未知(unknown significance)的基因突变也被检出，NOTCH1外显子34和外显子16的基因内重排在1例中检出(4821),酪氨酸激酶ros/胰岛素受体家族LTK错义突变在2例中检出(1954和4821),CTNNB1错义突变在1例中检出(1954)(图1)。

采用免疫组织化学染色的方法进一步在5例肿瘤中检测了腺上皮标记CK7、肌上皮标记p63、细胞增殖相关蛋白Ki-67、突变基因下游相关合成蛋白NICD、磷酸化AKTSer473和p53的表达。结果显示，5例肿瘤p63免疫染色均为阴性，CK7免疫染色在高转化级别区域呈弱-中阳性，表明高级别转化的细胞缺乏双向分化，肌上皮分化表达消失，腺上皮的分化也相对减弱。Ki-67阳性率50%以上，具有较高的增殖能力。3例NOTCH1突变的肿瘤NICD均高表达，NOTCH1重排的1例NICD不表达。在病例4821中观察到p53呈弥漫性阳性表达。PI3K/AKT信号通路相关基因突变的4个肿瘤样本(4805、4822、1954、4816)中， pAKTSer473表达强阳性(图2,图3)。

表1 5例高级别转化腺样囊性癌的临床病理资料

图1 瀑布图显示了5例高级别转化中NOTCH1、PI3K通路相关基因、p53和FGFR2扩增等常见基因突变

图2 病例4821组织病理学和免疫组织化学染色

图3 病例4805组织病理学和免疫组织化学染色

3、讨论

ACC是腺上皮及肌上皮细胞组成的肿瘤，按照其生长方式，可分为筛状型、管状型和实体型。在同一肿瘤中，3种亚型常常混合出现。实性成分超过30%者，侵袭性比筛状、管状型更强。高级别转化腺样囊性癌是1999年Cheuks等[7]首次报道的一种罕见的ACC病理变异型，指在任何经典型(包括筛状、管状或者实体型)腺样囊性癌中出现异形性明显且增殖活性高的高级别癌成分，常见的为低分化腺癌和未分化癌。随后Seethala等提出了其诊断标准，ACC-HGT的组织病理学特点是细胞巢明显增大，可伴有乳头状及鳞状分化，常见粉刺样坏死；细胞异形性明显，细胞核大小和形状多变，泡状染色质，核仁大小增加，核分裂像多，间质常常可见纤维组织增生。ACC-HGT缺乏双向分化，肌上皮细胞分化缺失，免疫组织化学染色表现为肌上皮标记p63、SMA及S100表达阴性。

目前，国内外公认的ACC的治疗方案为外科手术辅助放疗。而ACC-HGT具有高度侵袭性，患者预后差，其显著的临床特征之一是高淋巴结转移率，约43%～57%,是经典型ACC淋巴结转移率的至少5～10倍[8]。在本研究中，60%(3/5)患者发生淋巴结转移，故预防性颈部淋巴结清扫对于ACC-HGT患者是很有必要的。此外， Zhu等[9]研究发现ACC-HGT患者生存时间明显短于实体型ACC患者(80～99个月vs 7.5～61个月)。在本研究中，随访时间为4～30个月，2例患者分别在术后23个月和25个月死亡，且2例患者发生远处转移，3例患者复发。显然，ACC-HGT相较于传统的ACC来说，复发率、转移率和死亡率更高。对此，我们应当为ACC-HGT患者制定个性化的治疗计划，以提高其存活率。从基因组水平研究ACC-HGT生物学机制，可为ACC-HGT的靶向治疗提供依据。

目前，由于ACC-HGT病例罕见，关于其分子生物学机制尚未清楚。已有研究报道，在ACC-HGT中，p53和细胞周期蛋白cyclin D1过表达，且有一小部分病例发生TP53突变[10,11]。Seethala等[12]和Nagao[13]发现原癌基因c-MYC表达升高及 ERBB2拷贝数增高与ACC高级别转化密切相关。对于伴有ACC-HGT的分子遗传学改变特征，我们还需要进行更深入地研究。此外，多数ACC-HGT病例显示肿瘤标本体积较大，但高级转化成分常常与传统型ACC混合存在，且成分占比较少，而以往的DNA测序常常是基于大块肿瘤组织进行分析，掩盖了其复杂的肿瘤异质性。因此，为了明确高级别转化的分子遗传学机制，本研究采用了显微切割的方法，首先对肿瘤石蜡切片进行染色，然后精准地挑选出HGT成分，应用Foundationone® CDX平台进行全基因组测序。结果显示，5例ACC-HGT中1例发生p53突变，4例发生了NOTCH1基因突变(3例为多位点基因突变),4例检测到PI3K/AKT通路相关基因突变。而且，这些基因突变的下游相关蛋白p53、NICD及PI3K信号通路相关蛋白pAKTSer473也会相应的高表达。NOTCH1基因编码NOTCH蛋白家族的一个成员，作为细胞表面受体，参与细胞信号的传递和调节。根据肿瘤环境的不同，NOTCH1可成为抑癌基因或者是致癌基因。在ACC中，本研究结果显示NOTCH1基因改变发生在异源二聚化结构域(heterodimerization domain, 氨基酸1571～1735)和PEST结构(氨基酸2424～2555),与多种肿瘤包括T细胞急性淋巴细胞白血病等NOTCH1突变情况相似[14],导致蛋白NICD过表达，发挥肿瘤致癌基因的作用。NOTCH1的基因内重排(外显子34和外显子16),其基因功能目前尚未见文献报道，本研究免疫组织化学研究结果显示病例4821中NICD表达呈阴性，推测NOTCH1重排无法激活NICD蛋白，但由于病例数尚少，还需进一步研究。此外，MYB-NFIB融合不是发生高级别转化的必要条件。以往的研究及我们以前的相关研究认为NOTCH1突变是实体型ACC肿瘤发生的基础和关键[15,16],结合本研究测序结果，提示HGT可能不是低级别ACC的突然转变，而是更易从实体型ACC转变而来，发生NOTCH1突变的实体型ACC易发生高级别转化。PI3K/AKT通路相关基因包括编码PI3K催化亚基p110α的PIK3CA,编码PI3K调控亚基p85α的PIK3R1及编码肿瘤抑制蛋白磷酸酶2(PP2A)B调节亚基的基因PPP2R2A在4例中检测到突变，且其中3例同时发生NOTCH1突变。因此，联合使用γ -分泌酶抑制剂(抑制NOTCH信号通路)与PI3K/mTOR激酶抑制剂可能有效抑制高级别转化ACC的发生及发展，为高级别转化ACC患者的靶向用药提供了新的治疗思路。

ACC-HGT是ACC罕见的病理类型，相比经典型ACC,它侵袭性更强，预后更差，对于ACC-HGT患者应该采用个性化的治疗方案。本研究首次采用显微切割的方法，基于二代测序较准确且全面地分析了高级别转化ACC的分子遗传学改变，为其生物靶向治疗奠定了理论基础。

基金资助:国家自然科学基金青年项目(编号:82103405);

文章来源:刘胜楠,顾挺,张莺等.基于二代测序探索头颈部高级别转化腺样囊性癌分子遗传学特征[J].口腔医学研究,2024,40(02):161-165.