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DNA倍体分析对液基细胞学在良恶性胸腹水诊断中的支持价值

2024-05-09 62 上传者：管理员

摘要：目的:探讨液基细胞学、肿瘤标志物和DNA倍体分析单独和联合在良恶性胸腹水诊断中的鉴别价值。方法:收集312例同时做过胸腹水液基细胞学检查、DNA倍体分析和血清肿瘤标志物检测的病例，且所有病例都有组织病理诊断结果，对这些指标及人口统计学特征进行分析；基于液基细胞学、肿瘤标志物、DNA倍体分析单独及其组合的诊断，通过Logistic回归建立组合模型，并通过ROC曲线下面积(AUC)进行比较，以及计算其对应的敏感度(SE)、特异度(SP)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。结果:以组织病理诊断结果为金标准，液基细胞学、肿瘤标志物和DNA倍体分析的AUC值分别是0.702、 0.512、0.776;模型1(液基细胞学联合肿瘤标志物)AUC值为0.722,SE为49.8%,SP为90.6%,PPV为79.5%,NPV为24.5%;模型2(液基细胞学联合DNA倍体分析)AUC值为0.783,SE为68.7%,SP为83.00%,PPV为95.2%,NPV为35.2%;模型3(模型2联合肿瘤标志物)AUC值0.776,SE为58.7%,SP为88.7%,PPV为85.3%,NPV为29.8%;模型2表现出对良恶性胸腹水最高的诊断效率，液基细胞学和DNA倍体分析组合的AUC值高于液基细胞学(P<0.000 1)和DNA倍体分析(P=0.399 8)。结论:DNA倍体分析的诊断价值高于液基细胞学和传统肿瘤标志物；DNA倍体分析对液基细胞学在良恶性胸腹水的诊断中具有支持价值，提供了一种鉴别良恶性胸腹水的可靠模式。

关键词：
DNA倍体分析
ROC曲线
液基细胞学
肿瘤标志物
胸腹水
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生理状态时胸腹腔内有少量液体(腹腔内液<200 mL,胸腔内液<15 mL),是对人体具有积极的作用，但当胸腹腔内的液体超过正常限度时就提示机体可能处于病理状态[1]。不同性质的胸腹水病因不同，病人的治疗和预后就截然不同，因此对胸腹水的性质鉴定，特别是良恶性胸腹水的鉴别诊断具有重要的临床意义。临床应用最为广泛的脱落细胞学检查方法是液基细胞学检查[2]。将胸腹水中的脱落细胞富集到较小的范围内对细胞进行分类鉴别，相较于传统的细胞涂片法准确性较高，但由于缺乏组织学结构观察，仅依据常规染色，极易造成漏诊和误诊，因此临床需要联合其他检查方法[3]。

传统的血清肿瘤标志物检测，一般特异性较低，在感染等因素影响下极易造成假阳性结果。DNA倍体分析能在分子水平快速测定细胞内 DNA 含量，从而判断肿瘤细胞的性质，具有较强的客观性和敏感性，阳性检出率高于常规细胞学的方法[4]。已有研究报告显示联合液基细胞学检查和DNA倍体分析可明显提高宫颈癌早期筛查的阳性率[5]。但二者联合用于胸腹水的良恶性诊断却鲜少报道。本研究构建联合检测模型分析其在良恶性胸腹水鉴别诊断中的应用价值。

1、资料与方法

1.1 一般资料

收集郑州大学第二附属医院病理科2020年11月至2022年07月期间312例同时做过胸腹水液基细胞学检查、DNA倍体分析和血清肿瘤标志物检测的病例，且所有病例都有组织病理诊断结果。其中209例腹水，103例胸水，以组织病理诊断为金标准，恶性259例，良性53例。

1.2 方法

1.2.1 液基细胞学检查

(1)将50 mL离心管和液基滤膜玻片对应胸腹水标本编号；(2)一般对于液体浑浊的，直接吸取原液1 mL置入液基滤膜玻片中，800 r/min×5 min离心；对于标本液体清亮的，用两个50 mL离心管2 500 r/min×5 min离心液体，离心完后倒去上清液，留5 mL液体，用吸管吹散细胞团，吸取1 mL左右置入液基滤膜玻片中，800 r/min×5 min离心；(3)将滤膜去掉，上层液体倒掉，抽离玻片并将玻片立即置于95%酒精中固定12 min左右；(4)HE染色封片；(5)结果判读。

1.2.2 DNA倍体分析法

(1)用液基细胞学制片方法制片。(2)使用BS固定液(80 mL甲醇+15 mL甲醛+5 mL冰醋酸)固定30 min以上。(3)流水冲洗3次。(4)5N盐酸在60 ℃水浴中酸解25 min。(5)流水冲洗3次。(6)Feulgen染色：将切片置于DNA染液(Schiff试剂)中浸染50 min。(7)用亚硫酸水漂洗3次，每次5 min, 然后用流水冲洗3次。(8)脱水：分别经50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇和无水乙醇脱水各2次，每次1 min。(9)吹干封片，贴对应的条形码。(10)由麦克奥迪切片扫描仪、计算机等硬件完成对切片的数字化扫描，再由MotiCytometer(V2.0)和MotiClassify(V1.0)软件对扫描出来的数字切片进行细胞分类及计数。(11)结果判定标准：①标本片的积分光密度(IOD)应在100～140之间，并且扫描细胞数目不少于1 000;②正常细胞的DNA指数(DI值)应为1,DI>2.5为异常细胞；如图1所示的1例阳性胸水标本DNA倍体分析检测的结果。

图1 1例阳性胸水标本DNA倍体分析检测结果

1.2.3 肿瘤标志物检测

根据发病部位选择不同的血清肿瘤标志物，检测方法采用化学发光法，检测仪器为美国雅培I2000。

1.3 统计学分析

应用SPSS 26.0软件和MedCalc19.0.4进行数据分析，采用受试者工作特征曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)、敏感性(SE)、特异性(SP)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)用于描述各指标单独或联合诊断的效能。计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验，Delong检验用于比较ROC曲线之间的AUC差异，以P<0.05为差异有统计学意义。当约登指数最大时确定DNA倍体异常细胞数的CUT-OFF值。

2、结果

2.1 患者特征

本研究共筛选了312例患者，其中胸水103例，腹水209例，经病理诊断为恶性的有259例(83.1%),良性是53例(16.9%),男性86例(27.6%),女性226例(72.4%),平均年龄(56.5±14.53)岁，年龄中位数为58。良性组和恶性组在性别方面有显著差异(P=0.003),在年龄方面无显著差异(P=0.171)。

2.2 液基细胞学、DNA倍体及肿瘤标志物的结果判定

液基细胞学的判定标准：未见癌细胞为阴性，查见异形细胞、可疑癌细胞或癌细胞结果为阳性。如图2A所示1例良性腹水的液基细胞学检测结果：可见大量淋巴细胞；图2B所示1例含异形细胞的腹水，细胞大小不一，细胞核增大，核形态各异；1例含可疑癌细胞(图2C),细胞增大，细胞核深染，染色质粗；1例恶性胸水(图2D),腺癌细胞，可见细胞大小不一，核质比明显增大，核深染，染色质粗，可见病理性核分裂象。

图2 液基细胞学结果判读(HE×400)

根据DNA倍体分析计数的ROC,当以DNA倍体异常细胞数大于0为分界点时，Youden指数最高(50.2),细胞计数结果为整数，因此选择DNA倍体异常细胞数≥1来鉴别良性和恶性胸腹水，DNA倍体异常细胞数1为最佳CUT-OFF值，SE为67.2%(174/259),SP为83.0%(44/53),PPV为95.1%(174/183),NPV为34.11%(44/129)。因此无DNA倍体异常细胞时为阴性，DNA倍体异常细胞数≥1时为阳性。

血清肿瘤标志物检测结果在参考值范围内判为阴性，大于参考值范围判为阳性。

312个病例的液基细胞学结果、DNA倍体分析结果与肿瘤标志物结果以及病理结果见表1,有174例患者DNA倍体分析结果为阳性且病理结果为恶性，仅有9例患者DNA分析结果为阳性但病理结果为良性；有130例患者液基细胞学检查结果为阴性，但最终病理结果却为恶性。

表1 312个病例的液基细胞学、DNA倍体分析与肿瘤标志物结果以及病理结果n

2.3 不同方法的ROC曲线分析

根据良性和恶性肿瘤组的液基细胞学结果、DNA倍体分析计数、肿瘤标志物水平绘制ROC曲线，液基细胞学、DNA倍体分析、肿瘤标志物曲线下面积AUC值分别为0.702、0.776、0.512,见图3A, 以DNA倍体分析ROC曲线下面积最大。液基细胞学联合肿瘤标志物检测构建模型1,液基细胞学联合DNA倍体分析构建模型2,液基细胞学联合DNA倍体分析以及肿瘤标志物构建成模型3,三种模型的ROC曲线下面积AUC值分别为0.722、0.783、0.776,见图3B。在液基细胞学、DNA 倍体分析、肿瘤标志物单独或联合应用中，液基细胞学与DNA倍体分析组合的模型2的ROC曲线下面积最大。

2.4 液基细胞学、DNA倍体分析、肿瘤标志物单独和联合应用在良恶性胸腹水中的诊断效能

AUC值、敏感度(SE)、特异度(SP)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)用于评价液基细胞学、DNA倍体分析、肿瘤标志物单独和联合检测模型鉴别良恶性胸腹水的诊断效能。液基细胞学的诊断效能评价见表2,SE为49.80%,SP为90.60%,PPV为96.30%,NPV为30.00%;DNA倍体分析的SE为67.20%,SP为83.00%,PPV为95.10%,NPV为34.10%;肿瘤标志物检测的 SE为72.20%,SP为30.20%,PPV为83.50%,NPV为18.20%;液基细胞学联合肿瘤标志物(模型1),SE为49.80%,SP为90.60%,PPV为79.50%,NPV为24.50%;液基细胞学联合DNA倍体分析 (模型2),SE为68.70%,SP为83.00%,PPV为95.20%,NPV 为35.20%;模型2联合肿瘤标志物(模型3)SE为58.70%,SP为88.70%,PPV为85.30%,NPV为29.80%。模型2的诊断效率高于模型1(P=0.015 8),值得注意的是，与模型2相比，模型3并没有提高诊断效能。

图3 不同方法的ROC曲线分析

表2 液基细胞学、DNA倍体分析、肿瘤标志物单独和联合应用在良恶性胸腹水中的诊断效能

3、讨论

液基细胞学是良恶性胸腹水筛查的基础技术，具有简单便捷的优势[6]。本研究计算出液基细胞学筛查良恶性胸腹水的AUC值为0.702,敏感度为49.80%,特异度为90.60%,筛查敏感性较低，在本研究病理学阳性患者中有130例漏诊，故仍需联合其他诊断方法提高筛查准确性，高敏感性和低漏诊率应作为首要考虑指标。液基细胞学联合肿瘤标志物后(模型1),并没有改变液基细胞学的敏感度(49.8%)和特异度(90.60%),肿瘤标志物在癌症诊断、病理分型及预后评估中极易受多种因素影响，造成假阳性或假阴性，影响临床有效判断，即使联合多种肿瘤标志物水平检测，也未能达临床理想水平[7]。

肿瘤的本质是细胞内DNA结构或功能改变导致细胞的增殖失控或分化异常。通过对细胞核内DNA含量的变化可以判断出细胞状态及增殖情况。正常人体细胞为二倍体细胞，很少会出现多倍体细胞和非整倍体细胞[8,9]。当各种疾病导致细胞发生良恶性增生时，细胞DNA会发生非整倍体变化。细胞DNA倍体的改变是癌细胞的早期改变，发生在细胞形态改变之前，通过电脑及显微镜自动记录、识别、分类每个细胞，对细胞核内DNA定量检测可以提早发现病变细胞，DNA倍体分析在宫颈高级癌前病变和癌性病变的早期检测中具有良好的性能[10],在结肠腺癌中，对溃疡性结肠炎和其他结肠炎的DNA倍体进行评估可以在结肠发育不良发生之前预测即将发生的恶性转化[11],同样的对从口腔潜在恶性病变中收集的细胞进行DNA倍体分析可以提前几年识别出进展高风险的病变[12,13]。另外DNA倍体状态可以作为诊断或预后的一个重要的客观参数，补充传统的临床病理学特征及评估癌症预后的工具。DNA倍体分析在葡萄胎的准确诊断中发挥重要作用[14]。对乳腺癌和结直肠癌的研究中发现，DNA非整倍体的恶性肿瘤具有高增殖活性和高转移或侵袭潜力，因此与二倍体的肿瘤相比，会导致不良的预后[15,16]。

在本研究中DNA倍体分析的AUC值(0.776)大于液基细胞学(0.702)和肿瘤标志物(0.512),在本研究中液基细胞学诊断阳性的恶性胸腹水有129例，在这129例中，DNA倍体结果阳性病例有125例，阴性病例仅有5例，且在312个病例中有49例最终病理结果诊断为恶性的患者，液基细胞学检查为阴性而DNA倍体分析结果为阳性，由此可见DNA倍体分析可以有效的补充液基细胞学诊断的不足，从而减低漏诊率。DNA倍体分析比常用的液基细胞学和肿瘤标志物显示出更好的诊断价值，DNA倍体分析有可能成为对良恶性胸腹水诊断更好的标记物。在我们构建的联合检测模型中，DNA倍体分析与液基细胞学组成的模型2显示出最高的诊断效能。

本研究分析了DNA倍体与人口基本特征之间的相关性，发现DNA倍体分析与年龄和性别的相关性较弱，此外，我们利用Logistic回归模型，将年龄和性别作为混杂因素进行调整，校正年龄和性别后发现DNA倍体变化对胸腹水的良恶性仍有显著影响(P=0.018)。尽管主要的统计分析产生了积极的结果，但仍需要更多样本量来进一步证实我们研究结果的实用性。在临床上，DNA倍体分析在对良恶性胸腹水鉴别中比肿瘤标志物有更高的诊断价值，联合应用液基细胞学在良恶性胸腹水的鉴别中具有更高的诊断价值。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金(编号:82001134);

文章来源:杨圆圆,刘恩杰,张云飞,等.DNA倍体分析对液基细胞学在良恶性胸腹水诊断中的支持价值[J].现代肿瘤医学,2024,32(11):2069-2073.