在中医和西医的理解中，均认为人体的器官、组织和细胞存在着一种动态平衡的稳态，而疾病的发生正因为外界的扰动因素强于各系统的调整、平衡能力。“老三论”和“新三论”与生命科学的融合，使得这种医学整体观得到了更深刻的发展。基于协同论的观点，人体作为一个开放的系统，物质和能量代谢会自发地趋于有序，这就形成了一种重要的机体平衡体系——代谢稳态。中医药被广泛证实能够通过代谢稳态调控达到治疗目的，但是以往研究只聚焦于其对经典代谢途径的影响，而这仅能代表代谢稳态的一部分。表观代谢物的概念由代谢组学领域权威学者Oliver Fiehn教授于2017年提出，为一种脱离其经典功能的代谢物[1]。表观代谢物通常在化学结构上与典型的代谢物相似，其可能在酶错误或化学损伤情况下，经过简单的、可逆转的结构修饰(如过氧化、硝化、乙酰化、酯化等)而生成，见图1。但随着时间的推移而获得了生物学功能，同时在一些疾病过程中也表现出重要作用。如肾表皮细胞中磷脂酰乙醇胺过氧化代谢产物的累积会导致急性肾损伤[2],脂肪酸硝化代谢产物可以竞争性抑制促炎脂蛋白复合物的生成进而起到抗炎作用[3],脂肪酸肉碱结合代谢产物可以抑制谷氨酸转运体(sodium-and chloride-dependent glycine transporter 2,GlyT2),进而表现出潜在的止痛作用[4]等。因此，经典代谢途径的代谢物与表观代谢物之间的修饰/脱修饰反应可以看作是机体一种新的代谢稳态，而中医药能否通过表观代谢调控达到纠正机体病理状态的目的，可能是未来一项重要的研究方向。本文意在根据现有研究，阐述中医药作用模式与表观代谢调控之间的潜在关系，以及未来的研究方向和研究方法。

图1 表观代谢发生模式及其生物功能  

1、中医的整体观与西医的稳态学说

法国生理学家C.Bernard于19世纪中叶首次提出了内环境与内环境恒定的概念。1926年美国生理学家B.Cannon正式提出了稳态(Homeostasis)的概念。在生命科学中，稳态是指机体在一定的时空范围内，通过有序协调的功能活动，使机体的各种频率节律浓度和水平在相对狭窄的范围内保持稳定状态[5]。人体具有不同层次的稳态，大至人体整体稳态，小至各系统、器官和细胞稳态。机体的稳态是一种动态平衡，即稳态不是意味着人体某些参数的稳定，而是机体在环境不断变化中维持或者重新建立稳态的生理过程。这种调控作用是基于人体神经系统、内分泌系统和免疫系统等建立的负反馈、伺服及前馈等调控机制共同完成[6]。但是，机体这种稳态调控能力是有限度的，当内外环境的扰动因素过于强烈，会导致持续严重的稳态失衡，进入病理状态，即健康状态的维持很大程度上依赖于机体稳态的维持与调控。

中医理论体系以整体观念为指导，以阴阳五行学说为哲学基础和思维方法，以辨证论治为诊治特点，处处体现着中医的稳态观。首先，“天人相应”体现了人与自然的稳态，强调人需要食饮有节、起居有常，方能维持稳态平衡，防止外邪入侵。其次，整体观还体现在机体内部的稳态，中医认为人体以五脏为中心，通过六腑、经络、气、血、精、津液的作用，使机体功能处于有序、协调和稳定状态，而脏腑功能异常、经络不通、气血津液耗散均为机体稳态失衡状态。进而以中医稳态调节为目标的治疗成为中医诊治的关键核心之一，其主要原则在于调和阴阳，形神共养，疏通经络，调和脏腑，调气活血。

2、代谢稳态与中医药的调控作用

机体稳态包含了许多范畴的平衡，如心理平衡、内环境平衡、酸碱度平衡、气血平衡等[7]。代谢稳态是机体稳态中一个重要环节。代谢是生物体内所发生的用于维持生命的一系列有序的化学反应的总称，是机体不断进行物质和能量交换的过程，可分为物质代谢和能量代谢。物质代谢(substance metabolism)是指物质在体内的消化、吸收、运转、分解等与生理有关的化学过程。一方面机体在生命活动中不断从外界环境中摄取营养物质，转化为机体的组织成分(同化作用);另一方面机体本身的物质也不断分解成代谢产物，参与到其他生命过程或者排出体外(异化作用)。能量代谢(energy metabolism)是指在物质代谢过程中所伴随的能量释放、转移、贮存和利用。机体从外界摄取的营养物质，经过体内分解吸收，其中蕴藏的化学能转化为组织和细胞可以利用的能量，人体利用这些能量来维持生命活动。因此，代谢与生命过程中每一个环节都息息相关，而代谢的稳态平衡也是机体健康的必要条件。首先，机体在物质代谢中同化作用与异化作用遵循一种平衡的状态，细胞增殖、器官和组织的生长，均需要吸收外界营养物质转化为新的细胞或组织，如果异化作用过强，或者人体没有吸收足够的营养物质，则会引起物质代谢失衡，最终导致机体的衰弱、营养不良。而同化作用过强也会使机体处于病理状态，如癌细胞的特点在于过度增殖，而细胞的增殖需要大量的物质与能量供应，因此，癌细胞的代谢特征明显异于正常细胞，其能够通过PI3K/RAC-Akt、Ras、myc、Rb家族蛋白等信号作用，促进癌细胞从外界摄取葡萄糖和谷氨酰胺，用于细胞物质合成并产生额外能量[8]。

中医通过调控代谢稳态治疗疾病已被广泛研究：(1)中医药调控物质代谢平衡。一如机体的糖脂代谢失衡会导致心脑血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病的发生。脂质代谢障碍是动脉粥样硬化的病变基础，进一步导致多种心脑血管疾病，清血消脂方在动物实验中被证实可以减少动脉粥样硬化斑块、降低血脂水平和血清氧化三甲胺(trimethylamine oxide, TMAO)含量，同时能够通过调控Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)-NF-κB轴影响胆固醇代谢，减缓动脉粥样硬化表型[9]。一如骨代谢失稳是股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head, ONFH)的主要原因。过量饮酒及糖皮质激素的使用可以抑制成骨细胞的分化，破坏骨稳态，影响骨重塑过程中的正常代谢，日久导致ONFH的形成[10]。三七总皂苷可以增加成骨诱导因子(bone morphogenetic protein 2,BMP2) mRNA表达，诱导骨髓基质干细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞[11]。(2)中医药调控能量代谢平衡[12]。一方面，中医学中所述元气与生理学中的线粒体在来源、功能上非常相似。元气源于肾中先天之精气，受脾胃水谷精气及肺吸入之清气补充，遍布五脏六腑、四肢百骸，发挥推动、温煦、防御、固摄等作用，是构成人体和维持人体生命活动的原始物质和原动力[13]。而线粒体被称为细胞内的“能量供应站”,通过将吸收、消化的食物和呼吸摄入的氧气结合进行氧化磷酸化反应，为机体提供主要的能量，用于维持体温、调控细胞生长[14]。另一方面，中医脏腑学说中脏腑的运动方式与能量代谢关系密切：脾主运化，是水谷精微进入机体的关键，负责物质与能量的进入；肝主疏泄，负责物质与能量的储备、转化和转运；肺主气司呼吸，负责物质与能量的代谢；心主血脉和神志，负责物质与能量的调控，肾司二便，负责代谢终产物的排泄[15]。因此，通过脏腑功能调控人体能量代谢也是中医药作用机制之一，如酸枣仁汤可以通过提高Na+ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，维护细胞代谢稳态、减少细胞线粒体凋亡、增强线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅳ活性、增加ATP含量、提升线粒体内三羧酸循环速率等途径，减轻老年慢性睡眠剥夺模型大鼠下丘脑、心脏、肝脏内线粒体肿胀、变形等超微结构损伤，改善睡眠剥夺引起的能量代谢异常[16,17]。安寐丹可通过上调参与线粒体生物合成、分裂及融合功能的关键蛋白核呼吸因子1、线粒体转录因子A、动力相关蛋白1、线粒体融合蛋白2,缓解睡眠剥夺导致的线粒体结构损伤，从而纠正能量代谢紊乱，发挥改善失眠作用[18,19]。

3、表观代谢调控与疾病的发生

表观代谢可看作是经典代谢途径之外的代谢物结构修饰总和，这些结构修饰包括过氧化、硝化、乙酰化和酯化等，见图2。表观代谢能够改变原型代谢物的生物活性，进而参与某些病理过程中。了解表观代谢结构修饰可能提供一种新的病理机制调控方式，其中关键代谢酶也可能成为新的作用靶点。目前，虽然还没有被定义为表观代谢的功能研究，但是结构修饰代谢物的生物活性已经被广泛报道，这些都可以看作表观代谢的生物学意义。

图2 机体主要的表观代谢类型   

3.1 调节炎症反应

游离脂肪酸在二氧化氮自由基(·NO2)等氮自由基的作用下会生成硝化脂质(NO2-Fatty acid, NO2-FA),如硝基烯烃。硝基烯烃中与硝基键合碳相邻的β-碳具有潜在的亲电活性，其可能通过Michael加成反应与亲核基团(如Cys或His残基)反应，产生新的碳-碳或碳-杂原子键结构[20,21]。基于此，硝化的脂质能够与多种炎症因子信号蛋白发生亲电结合进而影响其生物功能。如azPC[22]、LNO2和OANO2[23]能够结合并激活PPARγ。Cui等[23]证实LNO2和OANO2可以通过作用于PPARγ抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起的炎症因子分泌。Wright等[24]报道，LNO2可以通过PPARγ非依赖性、NO依赖性和非依赖性机制诱导血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)的表达。硫酸化修饰的代谢物也会产生类似硝化的活性亲电基团，如雌二醇可通过胞质硫转移酶1E1(sulfur transferase 1E1,SULT1E1)硫酸化为硫酸雌二醇(estradiol sulfate, E2S)进而作用于PPARγ,其对炎症因子的调控作用与雌二醇完全相反[25],这也证实表观代谢产物与原型代谢物功能上的显著差异。

另外，NO2-FAs能有效拮抗NF-κB并激活Nrf2。NF-κB在p65上的Cys38被硝基烷基化后其活性会被显著抑制，导致其通过蛋白酶体途径降解[23]。NO2-FAs也可以共价修饰IKKβ,阻断IKKα磷酸化并抑制IκB-α磷酸化及其降解[26]。对上游NF-κB级联信号研究表明，NO2-FAs降低了TLR4的表达，并降低了TLR4和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)向脂筏的转移，随后抑制了IKKβ磷酸化、IκB-α的磷酸化和泛素化[27]。总之，所有这些作用都抑制了下游NF-κB信号传导和活性，进而抑制LPS诱导的巨噬细胞中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、TNF-α和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的分泌[23,28]。基于其抗炎和抗氧化作用，OANO2对肾、肺纤维化[29,30]和肺动脉高压[31]均具有改善作用。此外，NO2-FA能够通过烷基化Keap-1中两个功能重要的半胱氨酸残基(Cys-273和-288)活化Nrf2相关基因[32,33]。Nrf2是一种转录因子，由于Keap1,它在胞浆中处于非活性状态。Keap1的结构中富含半胱氨酸，因此极易发生硝基烷基化而被NO2-FA抑制，导致Nrf2迁移到细胞核，并作为异二聚体结合到DNA中的ARE,激活HO-1的表达。

3.2 调节脂质代谢

胞质硫转移酶2B1b(sulfur transferase 2B1b, SULT2B1b)能够催化氧化胆固醇硫酸化。25HC3S作为一种硫酸化的胆固醇，可以通过抑制SREBP-1c信号降低细胞内脂质水平，这种调节特性与原型25-羟基胆固醇的作用完全相反。小鼠给予25-羟基胆固醇并通过SULT2B1b过表达能显著增加肝组织中25HC3S的形成，进而降低血清和肝脏脂质水平，其机制可能在于25HC3S抑制了参与脂质代谢的关键调节分子和酶，包括LXR、SREBP-1、SREBP-2、乙酰辅酶A羧化酶-1(acetyl CoA carboxylase-1,ACC-1)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)[34]和HMG-CoA还原酶ABCA1[35,36]。OANO2可以通过抑制SREBP1蛋白水解激活和脂肪生成基因表达调节脂肪生成和分解途径。Rom等[37]证明OANO2可减少肝脏脂质积累、小叶炎症和纤维化，进而缓解肝损伤，同时可以抑制肝细胞中三酰甘油的生物合成和积累。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LO)是白三烯生物合成中的关键酶，白三烯是宿主防御反应和炎症疾病的生物介质。硫酸化的胆固醇代谢产物能够直接抑制5-LO酶活性和代谢产物合成，并阻碍人多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes, PMN)中5-LO向核被膜的转运[38,39]。SIRT6对调控葡萄糖和脂质稳态至关重要，并在DNA氧化损伤条件下参与维持基因组稳定性。亲电的NO2-FA能有效激活SIRT6,其机制同样在于亲电基团与SIRT6 N末端的残基Cys-18形成共价Michael加合物引起构象变化，导致其活性增强(20 mmol·L-1时为40倍),而油酸无此作用[40]。

3.3 参与程序性死亡的发生

脂质的过氧化代谢产物会参与一些细胞程序性死亡过程。如铁死亡是一种铁依赖性的新型程序性细胞死亡，其主要机制：在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高度表达的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡；谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)被抑制也会导致细胞铁死亡，因为GPX4是机体抗氧化系统的核心调节酶。因此，脂质过氧化表观代谢可被认为是一种铁死亡的驱动力[41]。有学者研究发现，在GPX4敲除小鼠中，过氧化PC和PE的水平显著升高，过氧化PE和PC在肾和肺组织的积累会造成肾上皮细胞和气道上皮细胞的铁死亡[2,42],进而导致急性肾损伤和哮喘。

3.4 调节血管扩张作用

NO在体内具有血管扩张作用，当硝化脂质异构化为相应的亚硝酸盐衍生物时，会通过均溶和(或)金属离子/抗坏血酸盐辅助的还原反应产生NO[43]。生成的NO会表现出内皮非依赖性血管舒张作用。如Balazy等[44]报道，花生四烯酸与NO的反应混合物可激活可溶性鸟苷酸环化酶，以松弛内皮剥夺的牛冠状动脉。Lima等[43]报道了亚硝酸酯、亚硝酸胆固醇酯和亚硝酸羟酯可以诱导大鼠主动脉环血管舒张。LNO2可以剂量依赖性(0.5～10 μmol·L-1)抑制凝血酶介导的人血小板聚集，而亚油酸或3-硝基酪氨酸则不能。这可能是由于LNO2在cAMP依赖性蛋白激酶选择位点serine 157处减弱了P-selectin的表达和血管舒张剂激活磷蛋白的选择性磷酸化[45]。

4、中医药表观代谢调控的可能性及其研究方法

综上所述，众多实验研究表明中医药能够通过调控代谢稳态达到治疗疾病的目的。然而，以往中医药代谢调控研究采用的手段主要是非靶向代谢组学和对特定代谢物用生化方法进行定量研究，这在方法学上决定了以往研究只关注“经典代谢途径”的代谢物在“量”的“稳态”,而缺乏关注中医药是否在代谢调控中，同样协调了代谢物结构上“质”的变化，即经典代谢物与表观代谢产物之间的反应平衡。目前，一些研究结果提示，中医药可能通过维持表观代谢稳态达到治疗疾病的目的。如3.3项所述，脂质的过氧化表观代谢通过引起细胞铁死亡而参与多种病理过程。朱利等[46]综述了中医药通过调控脂质过氧化和铁死亡机制改善动脉粥样硬化的研究，表明二陈汤合桃红四物汤以及四君子汤等中药复方能够通过升高体内谷胱甘肽(glutathione, GSH)活性、降低活性氧水平，进而通过抗氧化作用防止细胞铁死亡。郑合昇等[47]综述了中医药通过调控脂质过氧化和铁死亡治疗帕金森病的研究，表明补肝养肾止痉汤、芪蛭通络胶囊等11种复方在临床和动物模型研究中能够降低活性氧水平，上调Nrf2、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的表达和GSH水平，进而改善脂质过氧化。

但是，中医药表观代谢调控研究仍相对薄弱，其主要原因在于人们对表观代谢本身的认识有限，另一方面是缺少系统的、有效的分析方法。目前，对于表观代谢产物的研究主要基于改良的代谢组学。对于传统的非靶向代谢组学，其首先通过质谱进行无偏的样品分析，找到差异的离子特征，再将这些离子特征在数据库中进行查找鉴定。而这些常用的数据库中大多是已知的经典代谢途径的代谢物，而未知的表观代谢物如果不在库中，则无法被注释。因此，扩展现有的代谢物质谱信息库以涵盖表观代谢产物是目前主要的研究方向。机体代谢反应大多是由代谢酶催化的，即一定的代谢酶识别具有特定基团的底物进行催化，发生代谢反应。因此，基于已知的酶促反应类型，通过机器学习的方法，构建表观代谢产物的预测模型。实现输入结构式的smile等格式文件，模型可预测其可能发生哪些酶促反应。如图3展示BNICE的工作示意图[48],该算法基于4种酶促反应式进行机器学习后，可以推测具有1,3-二酮结构的代谢物均可能得到一分子水而发生裂解，生成一分子羧酸和一分子甲基酮。

如果对已知代谢物数据库中的所有代谢物的表观代谢产物进行预测，并得到相应的质谱信息纳入扩展的数据库，这时代谢物数据库可以被扩大几个数量级，以包含表观代谢产物结构，供代谢组学研究进行差异代谢物注释。目前，此类数据库有MINE[48]、MyCompoundID tool[49]、the In Vivo/In Silico Metabolites Database (IIMDB)[50]、LipidHome[51]和其他一些模型[52,53]。基于这些扩展数据库的代谢组学方法会在以后更多地用于研究表观代谢参与的病理生理过程，并进一步形成表观代谢组学策略，以推动对中医药表观代谢调控的认知。

图3 BNICE代谢反应预测模型的分析模式   

5、讨论

目前的实验证据提示，调控表观代谢稳态可能是中医药治疗机制中的重要环节，而发展中医药表观代谢调控理论的困难主要在于方法学。表观代谢调控在现代医学研究中仍是一个新课题，缺乏完善的研究体系，虽然有些质谱数据库涵盖了表观代谢产物，但这些信息多是基于结构预测，缺乏实验证实，目前也没有可获得的标准品进行结构确证。同时，表观代谢产物往往浓度极低，如何提高检测方法的灵敏度也亟待解决。即使确证了表观代谢物结构，其更深层次的生物学机制也有待探讨，也缺乏表观代谢调控相关的蛋白或靶点网络的理论基础。因此，对于构建系统的中医药表观代谢调控研究策略，应该包括以下方面：(1)完善表观代谢产物质谱数据库，以便能够在非靶向代谢组学方法中找到中医药调控的表观代谢标记物。(2)为了提高检测灵敏度，可以通过合成和结构修饰的方法得到目标表观代谢产物，构建靶向代谢组学方法，或者基于非靶向代谢物鉴定结果，建立拟靶向分析方法。(3)通过结合转录组学、蛋白组学或生物信息学手段，分析中医药表观代谢调控的分子网络，定位关键调节酶，进而确定其作用靶点。由此可见，与以往把成熟的技术方法应用到中医药研究中不同，中医药表观代谢调控体系的构建需同时建立表观代谢研究方法和中药干预的论证研究，是一项挑战性工作，但由此可能推开一扇丰富中医药现代理论的大门。

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文章来源:刘新光,谢洋,李建生.表观代谢调控——中医药调控人体稳态研究的新方向[J].中医学报,2024,39(02):227-234.