糖尿病是我国最为棘手的公共卫生问题之一。2020年中国糖尿病总人数已跃居全球首位，其中30%～40%的糖尿病患者发展为糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)[1]。DN已成为导致终末期肾功能衰竭和糖尿病患者死亡的主要原因[2]。DN的发病机制至今尚未明了，其病程进展迅速、不可逆，临床采用降糖、降压联合治疗，效果亦差强人意。因此，早期发现DN并进行干预已迫在眉睫。DN属中医“水肿”“关格”等范畴，病位在肾，与肝、心、脾相关[3,4]。中医积累了大量治疗“消渴”“肾消”的经验，且中医药不良反应少、多靶点系统性治疗的特点备受瞩目[5,6]。

“证”是对疾病某一阶段病机本质的概括，具有相对稳定性；蛋白质的变化一定程度上也可以推断某时段某部位生理病理变化，具有相对稳定性。因此，蛋白质组学可以提供疾病证型丰富的、稳定的生物学信息，以便我们寻找和证实中医证型的微观物质基础[7,8]。有研究显示，差异蛋白与早期DN不同证候的形成有关[9,10]。本研究拟采用同位素标记的相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quan-tification, iTRAQ)标记的二维液相色谱串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 2DLC-MS/MS)方法，分析筛查出DN肾阴虚证和正常人群血浆中的主要差异蛋白质。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选择广州中医药大学第一附属医院2019年1月至2020年6月就诊的24例DN阴虚证患者，其中男11例，女13例；年龄(59.4±7.9)岁。选择同时期24例来自体检中心的健康人群作为对照组，其中男13例，女11例；年龄(58.2±10.6)岁。两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 病例纳入标准

(1)确诊早期DN:符合《中国糖尿病防治指南》(参照Mogensen分期标准)中早期DN:6个月内连续尿液检查有两次或两次以上尿白蛋白排泄率为20～200 μg·min-1,并可排除其他可能引起尿蛋白排泄率增加的原因(如酮症酸中毒、泌尿系感染、原发性高血压等)。(2)依据中华中医药学会《糖尿病中医防治指南》(2007年版)和《中药新药临床研究指导原则》(2002年版)糖尿病肾阴虚证候诊断标准。主症：腰膝酸软，五心烦热。次症：眩晕耳鸣，或耳聋，口燥咽干，潮热盗汗，或骨蒸发热，形体消瘦，失眠健忘，齿松发脱，遗精，早泄，经少、经闭，舌质红，少津，少苔或无苔，脉细数。具备主症和至少两项次症即可确诊。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂与仪器

iTRAQ蛋白检测试剂盒(美国Thermo fisher Applied Biosystems公司);2-D Quant Kit蛋白质定量试剂盒(美国GE Healthcare公司);胰蛋白酶(美国Promega公司);ProteoPrep®Blue白蛋白去除试剂盒(美国Sigma公司);Western blot相关抗体(英国Abcam公司);DIONEXUltiMate3000标准型液相色谱仪、Q-Exactive质谱仪(美国Thermo fisher公司);Phenomenex色谱柱(美国Phenomenex公司)。

1.3.2 样本制备

静脉采血5 mL,置于肝素抗凝管，离心20 min(2 000 r·min-1),取离心后上清液存放于-80 ℃冰箱。标本收齐后，来自10个随机选择的等量血浆样品混合成4个样本，命名为NC1和NC2组(NC=对照)以及DN1和DN2组(DN阴虚证组)。使用除高峰度蛋白试剂盒除去多数高丰度白蛋白及IgG;蛋白质被浓缩和脱盐后采用考马斯亮蓝G250法测定血清样品的总蛋白浓度。用胰蛋白酶将蛋白质样品(100 μg)消化成肽。根据说明书进行iTRAQ标记：iTRAQ 115标记NC1,iTRAQ 116标记NC2,iTRAQ 117标记DN1,iTRAQ 118标记DN2。将标记的样品涡旋混合，真空冷冻干燥。

1.3.3 质谱分析

用Sep-Pak Vac C18固相萃取柱将标记过程中相关盐分洗脱并浓缩。将混合肽再溶解于50 μL缓冲液，使用DIONEXUltiMate3000标准型液相色谱仪将100 μg样品加载到Gemini NX-C18色谱柱上分馏，缓冲液A(10 mmol·L-1 KH2PO4,25%ACN,pH值为2.6)和流动相B(10 mmol·L-1 KH2PO4,350 mmol·L-1 KCl, 25%ACN,pH值为2.6)梯度洗脱吸附在柱上的肽。洗脱的过程在214 nm的吸光度下监测肽浓度。总共收集10个组分，每个组分采用除盐柱除盐后冷冻抽干。采用缓冲液A(5%CAN,0.1%脂肪酸)复溶后，通过Q-Exactive质谱仪进行LC-MS/MS分析，MS/MS扫描400～1 500 m/z(质荷比)的20个最强烈的多重电荷离子进行分析。采用软件Protein Pilot 5.0蛋白质定性和定量分析。采用ProGroup算法识别肽，MS/MS数据通过人类国际蛋白指数数据库(HIPI,version 3.87)搜索。统计分析以组间表达差异倍数>2.0(上调)或<0.5(下调),且P<0.05为差异有统计学意义，筛选差异表达蛋白质。

1.3.4 生物信息学分析

对差异蛋白的生物学过程、细胞成分和分子功能分析参阅基因本体论(Gene Ontology, GO)数据库;京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析采用KOBAS3.0;蛋白与蛋白之间相互作用关系网络借助STRING软件完成。

1.3.5 Western blot检测筛选的蛋白表达水平

采用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白质(80 μg),并将其转移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。50 g·L-1脱脂牛奶封闭，一抗孵育过夜。TBSB洗涤3次后，加入适量的HRP偶联的二抗孵育1 h, TBST洗膜3遍，最后用ECL显影液曝光显色，利用化学发光成像系统进行显影，并且使用Image J软件分析灰度值，用目标蛋白条带与β-actin条带的灰度值之比表示目标蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，图像绘制采用GraphPad Prism 8软件进行，数据呈正态分布及方差齐性的条件下，两组比较采用Student t检验；否则采用非参数检验；多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 蛋白鉴定和差异蛋白的筛选

采用ProteinPilot®软件总共采集了339个蛋白质；与NC组比较，DN阴虚证组筛选出37个差异蛋白，其中上调的20个(差异倍数>2,P<0.05),下调的17个(差异倍数<0.5,P<0.05),见表1、表2。

表1 DN阴虚证组比NC组显著上调的20个差异蛋白质

表2 DN阴虚证组比NC组显著下调的17个差异蛋白质

2.2 GO注释

GO注释根据3个主要模块，将差异表达蛋白进行分类。差异蛋白质集中定位于细胞外隙(37个),细胞外区域(36个);分子功能主要参与蛋白结合(35个)、 信号受体结合(14个) 及脂质结合(12个)和运输活性(11个)。差异蛋白主要参与生物学过程为生物调节(35个)、生物过程调控(33个)以及对刺激反应(33个),见图1。

图1 DN阴虚证差异表达蛋白GO分析图(top 10)  

2.3 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果显示，差异蛋白主要涉及胆固醇代谢、补体及凝血级联反应、脂肪消化吸收等信号通路(图2),这些通路和心血管疾病有着明显关系。

2.4 生物学功能受蛋白-蛋白相互作用的复杂网络调控

为了更好地了解DN阴虚证的致病机制，将鉴定到的变化蛋白进行STRING构建和分析，相互作用可信度为0.9。结果发现很多蛋白处于相互作用网络交叉点，例如AOPAI、APOB、FGG、HP、ORM2等，提示其在DN肾阴虚证的发生、发展中发挥关键作用，见图3。

图2 DN阴虚证差异表达蛋白KEGG通路富集分析图   

图3 DN阴虚证差异表达蛋白-蛋白相互作用网络分析图   

2.5 Western blot检测差异蛋白表达水平

结果显示，在DN阴虚证组中，HP和FGG蛋白表达水平高于NC组，AOPAI表达水平低于NC组(P<0.05),Western blot结果与iTRAQ质谱结果具有一致性(图4)。

图4 Western blot验证各组蛋白差异表达情况   

3、讨论

DN病属中医“消渴病”范畴，是消渴病中晚期所产生的一种慢性并发症。消渴病是以多饮、多食、多尿、乏力、形体消瘦或尿有甜味为主要临床表现的一种病证[11]。中医认为，消渴病肾病病因多属本虚标实，病机为正气渐损、湿瘀渐盛[12]。消渴病初以燥热为主，渐致阴精不足，久则伤及阴阳，加之“久病及肾”,最终以累及肾阴、肾阳为主。肾阴虚证为DN的常见中医证型之一。肾虚阴亏，清窍失养，肾腑失济，故腰膝酸软、眩晕耳鸣、记忆力减退；阴虚而生内热，虚火内炽，故见五心烦热、潮热盗汗、咽干；舌红少苔、脉细均为阴虚所致[13]。

现代生物学技术如酶学、细胞生物学、免疫学以及分子生物学等被引入肾阴虚证的证型研究，提示肾阴虚证与免疫、物质与能量代谢、微量元素、酶以及基因表达等相关，初步证实DN具有病理生理学基础[14,15]。

血浆具有取材容易、应用广泛、富含蛋白质特点，血浆蛋白质组学可以在整体水平上研究中医证型血浆蛋白质的差异表达、相互作用等。有研究已经展开DN肾阴虚证血浆蛋白质组学研究，筛查蛋白质标记物和探究其发病机制[16]。iTRAQ蛋白组学技术是一项新的同位素标记技术，可同时对大样本样品进行绝对和相对定量研究，具有重复性好、准确把控差异蛋白动态变化的特点[17]。季青等[18]利用iTRAQ联合LC-MS/MS技术，筛选出大肠癌术后和肝癌术后肝肾阴虚证组共同差异蛋白8个，包括激肽原1、α1微球蛋白比库蛋白前体、血红蛋白β等。本研究利用iTRAQ联合LC-MS/MS技术，筛选出37个差异蛋白，其中上调的20个，下调的17个，通过交叉比对发现载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I,AOPAI)、APOB、纤维蛋白原(fibrinogen, FGG)、结合珠蛋白(haptoglobin, HP)、ORM2等差异蛋白位于相互作用网络交叉点，选取AOPAI、HP和FGG进行Western blot验证，与iTRAQ质谱结果一致。

AOPAI是维持血浆中高密度脂蛋白结构完整和稳定的主要结构蛋白[19]。AOPAI能够清除血管中的胆固醇，催化胆固醇酯化，是促进细胞胆固醇逆向转运和遏制动脉硬化的保护因子。脂代谢异常是引起DN患者发生微血管并发症的最主要也是最重要的因素，导致肾小球滤过率下降，最终形成严重的肾损害。Overgaard等[20]对大样本的DN患者采用质谱分析，显示AOPAI表达下调，在大量蛋白尿组尤为显著。中医认为，AOPAI为精微物质，当其减少时会导致体内阴精不足，形成肾阴虚证。本研究证实，DN肾阴虚证患者AOPAI呈现下调状态，该蛋白是DN肾阴虚证型物质基础之一，可以作为潜在的早期诊断标志物。

HP是肝脏合成的一种急性期应激蛋白，包括抗氧化、促进血管生成、抑菌、调节免疫、抗炎、调节一氧化氮等功能[21,22]。Costacou等[23]研究表明，HP是糖尿病患者早期肾损伤和发展为终末期肾病的一个独立决定因素。王美娟等[24]通过临床分析得出，尿HP可作为早期预测糖尿病患者肾功能下降的敏感指标。大量研究证实，HP对肾损伤极其敏感，轻微肾功能下降便导致HP明显升高。Asleh等[25]发现，HP糖尿病小鼠近端肾小管上皮细胞溶酶体铁沉积物增多，氧化还原铁浓度升高，导致溶酶体膜受损。消渴病肾阴亏虚，虚火燔灼，灼伤肾脏脉络，导致肾脏脉络受损。本研究表明，DN肾阴虚证患者HP呈上调状态，HP有望成为DN铁沉积物相关肾小管损伤治疗的新靶点。

FGG是由肝细胞产生的一种糖蛋白，参与凝血和止血过程。FGG升高直接诱导红细胞聚集和导致血液黏稠度增加，进而降低血液的流速和对血管壁的切流速度，最终导致血管损伤及血栓形成，出现循环障碍[26]。而消渴病阴液亏虚，虚火燔灼津液，血中津液不足，血液浓缩，导致瘀血阻滞。本研究显示，DN肾阴虚证患者FGG呈现上调状态，推测DN肾阴虚证与FGG高表达导致微循环障碍具有一定关联性。

本试验运用iTRAQ技术结合LC-MS/MS技术筛选出37个差异蛋白，发现AOPAI、APOB、FGG、HP等与DN肾阴虚证的发生发展密切相关，选取AOPAI、HP和FGG进行Western blot验证，结果与iTRAQ质谱结果一致。对这些蛋白功能和作用机制的深入研究将有可能筛选出DN早期诊断的生物标志物，为阐明中医肾阴虚证的物质基础提供依据。

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基金资助:广东省基础与应用基础研究基金联合基金项目(2019A1515110017);广东省医学科研基金资助项目(B2021056);广东省中医药局科研项目(202111220);东莞市科技特派员项目(20201800500142);广东医科大学学科建设项目(4SG21229GDGFYO1);

文章来源:耿宇轩,赵青,郭文涛等.基于iTRAQ技术分析早期糖尿病肾病肾阴虚证患者血浆蛋白质组学[J].中医学报,2024,39(02):400-405.