首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 中医医学论文 > 中药治疗论文 > 天麻素对脑缺血大鼠纹状体BDNF、IL-6表达的影响

天麻素对脑缺血大鼠纹状体BDNF、IL-6表达的影响

2024-03-27 15 上传者：管理员

摘要：目的：研究天麻素对脑缺血大鼠纹状体脑源性神经营养因子（BDNF）和白细胞介素-6(IL-6)表达的影响，探讨天麻素治疗脑缺血的可能机制。方法：大鼠随机分为4组：正常组、假手术组、模型组、天麻素组，每组10只。大脑中动脉栓塞法（MCAO）造模成功后，天麻素组腹腔注射天麻素注射液10 mg/kg,1次/d，连续14 d;Nissl染色观察纹状体神经元的病理变化；免疫组化检测BDNF、IL-6蛋白在纹状体的阳性表达情况；Western blot检测BDNF、IL-6蛋白在纹状体的表达水平。结果：Nissl染色结果显示：正常组和假手术组纹状体神经元结构清晰完整，细胞排列紧密。模型组较假手术组，细胞数量明显减少（P<0.01），出现明显的胞体萎缩情况，细胞排列疏松。天麻素组较模型组Nissl阳性神经元数量增多（P<0.01），细胞形态也有明显改善。免疫组化和Western blot结果一致：正常组与假手术组BDNF、IL-6蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组比较，模型组缺血侧纹状体BDNF蛋白表达水平降低（P<0.01）,IL-6蛋白表达水平升高（P<0.05,P<0.01）；与模型组比较，天麻素组缺血侧纹状体BDNF蛋白表达水平上升（P<0.05,P<0.01）,IL-6蛋白表达水平下降（P<0.05,P<0.01）。结论：天麻素对脑缺血导致的纹状体损伤具有显著的保护作用，其机制可能与上调抗炎因子BDNF、下调促炎因子IL-6有关。

关键词：
BDNF
IL-6
天麻素
纹状体
脑缺血
加入收藏

脑卒中是全世界第三大死因，其中缺血性脑卒中占脑卒中的比例高达80%[1]。天麻素（gastrodin,Gas）是天麻中的有效成分，临床研究证实，天麻素注射液在治疗神经系统疾病中，发挥了抗炎、抗细胞凋亡、神经元修复与保护等功效[2]。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）是神经营养家族成员之一，可维持神经元正常生理功能，调控轴突可塑性，修复受损神经元，是神经元网络系统稳态的关键因素[3]，脑组织中BDNF表达水平的波动与多种中枢神经系统疾病（如脑卒中、帕金森症和阿尔兹海默症等）有关[4,5]。白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6）是一种多效性促炎细胞因子，参与多种疾病的病理生理过程，抑制IL-6的表达，可抑制脑缺血后炎症反应，对脑缺血有一定保护作用[6]。本实验从BDNF、IL-6角度探讨天麻素对脑缺血后大鼠脑保护的作用机制，旨在为中药治疗脑缺血提供实验数据。

1、材料与方法

1.1 实验动物及分组

46只健康成年雄性SD大鼠，体质量（200±20)g，购自青龙山动物实验中心，合格证号：SCXK（沪）2018-0004。动物房内分笼适应性喂养7 d，饲养方法遵循皖南医学院动物伦理道德守则（编号：LLSC-2022-012）。采用随机数字表法将大鼠随机分为正常组（10只）、假手术组（10只）、模型组[大脑中动脉栓塞法（MCAO）造模使用大鼠26只，造模成功20只]，再将造模成功后的20只大鼠采用随机数字表法分为模型组和天麻素组，每组10只。

1.2 药品和试剂

天麻素注射液（货号：H200-64392，中国西南药业股份有限公司）；一抗BDNF（货号：DF6387，美国Affinity公司）；一抗IL-6（货号：DF6087，美国Affinity公司）；β-actin（货号：AF7018，美国Affinity公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G（货号：A0208，上海碧云天生物技术有限公司）；Nissl染色液（货号：C0117，北京天根生化科技有限公司）；SABC（货号：SA1022，武汉博士德生物工程有限公司）；ECL化学发光液（货号：P0018AS，上海碧云天生物技术有限公司）；栓线（型号：2432A2，北京西浓科技有限公司）。

1.3 动物模型制备及干预方法

参照Zea Longa造模法并加以改良，制备大鼠脑缺血模型[7]。1.5%戊巴比妥钠（2 m L/kg）腹腔注射麻醉，在大鼠颈部取正中切口，玻璃分针逐层分离皮下组织，分离并暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈内动脉近心端，动脉夹夹闭颈内动脉远心端。在颈内动脉近心端处作一V字型小切口，将套管针插入后，置入栓线，轻拉颈内动脉调整插入方向，松开动脉夹，继续插入栓线，使栓线头端到达大脑中动脉和大脑前动脉分叉处，阻塞大脑中动脉起始处[插入深度约（18.5±0.5)mm]，结扎颈内动脉，以固定栓线和防止出血。切口常规清理并缝合，消毒。造模后2 h（大鼠清醒时），观察其神经功能状态，若出现站立不稳、左侧肢体偏瘫、提尾向一侧转圈等神经功能损害症状，则为造模成功[8]。第2天开始给予治疗。

正常组、假手术组和模型组：不予任何治疗。天麻素组：给予天麻素注射液（10 mg/kg）腹腔注射，1次/d，连续14 d。

1.4 实验取材

实验干预14 d后，每组随机选取5只大鼠给予腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（2 m L/kg）麻醉，先输入0.9%生理盐水100 m L，后灌注4□的4%多聚甲醛溶液300 m L，取脑组织放入4%多聚甲醛中固定1 d，梯度酒精脱水（75%乙醇50 min、85%乙醇50 min、95%乙醇50 min、100%I乙醇20 min、100%II乙醇20 min），透明，浸蜡，包埋，用于Nissl染色和免疫组织化学染色。各组另外5只大鼠采用1.5%戊巴比妥钠（2 m L/kg）腹腔注射麻醉，直接在冰上取脑组织，快速分离右侧纹状体，放入-80□冰箱，用于Western blot。

1.5 Nissl染色法

石蜡切片，常规脱蜡至水后，Nissl染色液染色（按说明书操作），再脱水、透明、封片。显微镜采集400倍镜图片，Image J软件计算Nissl阳性神经细胞数量。

1.6 免疫组织化学染色法

石蜡切片，常规脱蜡至水，滴加3%H2O2(37□，12 min），切片微波修复（高火2 min，低火12～14 min），自然冷却，再依次滴加5%BSA小牛血清封闭液（37□，60min），一抗BDNF(1:100）、IL-6(1:100）。4□过夜，复温，再依次滴加山羊抗兔Ig G(37□，60 min),SABC(37□，60 min),HRP-DAB避光显色，镜下观察细胞、背景分明后，流水冲洗，封片。显微镜采集400倍镜图片，Image J软件测定BDNF、IL-6免疫阳性细胞数，Image-Pro Plus软件测定BDNF、IL-6免疫阳性细胞平均光密度值。

1.7 Western blot

右侧纹状体组织称重，加入裂解液，充分匀浆，提取总蛋白，测分子量，配胶，加样，电泳，转膜（110 V,100 min），封闭120 min，孵育一抗BDNF(1:1 000）、IL-6(1:1 000）、及内参β-actin(1:10 000），摇床4□过夜。孵育二抗山羊抗兔Ig G，摇床（室温，60 min),ECL显影液及Amersham Imager 600系统曝光，采集图像。Image J软件测量各组条带的灰度值，分别以BDNF、IL-6蛋白与β-actin蛋白（内参）灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学处理

实验数值均显示为均数±标准差，以统计图的形式呈现（Graph Pad Prism 9软件制作），使用SPSS 26.0软件统计分析。采用单因素ANVOA进行多组间分析，两个样本间采用Tu Key HSD检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 天麻素治疗减轻脑缺血大鼠纹状体神经元的损伤

Nissl染色显示：正常组与假手术组尼氏体呈蓝色，分布于纹状体神经元胞质中，胞核深染，细胞结构清晰完整，细胞排列紧密。脑缺血后尼氏体明显减少，模型组较假手术组，细胞数量明显减少（P<0.01），出现明显的胞体萎缩情况，细胞排列疏松。天麻素治疗后，尼氏体明显增多，Nissl阳性细胞数量明显增多（P<0.01），细胞形态也有明显改善，说明天麻素治疗减轻脑缺血导致纹状体损伤。见Fig.1。

2.2 天麻素治疗上调抗炎因子BDNF在缺血侧纹状体的表达

BDNF免疫阳性产物为棕黄色，表达于神经细胞的胞质，胞膜及突起上。正常组与假手术组BDNF蛋白免疫阳性表达差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组右侧纹状体BDNF蛋白免疫阳性细胞数量减少（P<0.01），单位面积内免疫阳性产物平均光密度值减少（P<0.01）；与模型组比较，天麻素组BDNF蛋白的免疫阳性细胞数量增加（P<0.01），单位面积内免疫阳性产物平均光密度值增加（P<0.05）。Western blot结果显示，正常组与假手术组之间差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组BDNF蛋白的相对表达量减少（P<0.01）；与模型组相比，天麻素组BDNF蛋白的相对表达量增加（P<0.01）。说明天麻素治疗增加脑缺血侧纹状体中抗炎因子BDNF蛋白的表达。见Fig.2。

2.3 天麻素治疗下调促炎因子IL-6在缺血侧纹状体的表达

IL-6免疫阳性产物为黄褐色，表达于神经细胞的胞质，胞膜及轴突上。正常组与假手术组比较，IL-6蛋白免疫阳性表达差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组右侧纹状体IL-6蛋白免疫阳性细胞数量增加（P<0.01），单位面积内免疫阳性产物平均光密度值增加（P<0.05）；与模型组比较，天麻素组IL-6蛋白的免疫阳性细胞数量减少（P<0.01），单位面积内免疫阳性产物平均光密度值减少（P<0.05）。Western blot结果显示，正常组与假手术组之间差异无统计学意义（P>0.05）；与假手术组比较，模型组IL-6蛋白的相对表达量增加（P<0.01）；与模型组比较，天麻素组IL-6蛋白的相对表达量减少（P<0.01）。说明天麻素治疗减少脑缺血侧纹状体中促炎因子IL-6蛋白的表达。见Fig.3。

3、讨论

临床近90%的缺血性卒中患者表现出大脑中动脉闭塞[9]，本实验采用大脑中动脉栓塞制备大鼠脑缺血模型，与临床发病相符。大脑中动脉发出的中央支又称豆纹动脉，垂直向上进入脑内，分布于纹状体。研究表明单侧大脑中动脉闭塞所致脑梗死，可引起纹状体发生神经元坏死、轴突变性、染色质溶解[10]。纹状体是大脑基底核的一部分，参与锥体外系的组成，可调节肌张力，协调随意运动。缺血性脑卒中患者常出现肌张力增高，随意运动障碍。因此，脑缺血后患者出现的临床症状可能与纹状体区的神经元受损有关。

本实验通过Nissl染色发现，模型组大鼠缺血侧纹状体Nissl阳性神经元数量较假手术组明显减少，部分神经元的形态也发生了改变，细胞缺损、甚至萎缩，提示缺血侧纹状体神经元出现明显损伤。天麻素治疗脑缺血后，受损区纹状体Nissl阳性神经元数量较模型组增加，提示天麻素在治疗脑缺血中发挥了神经元的修复和保护作用。本实验小组前期研究发现，天麻素注射液（10 mg/kg）可减轻脑缺血大鼠的肺损伤[8]，本研究继续使用该剂量，进一步验证了该剂量在治疗脑缺血大鼠的神经损伤中是有效的。

中药具有安全性高的优点，天麻素是天麻中的有效成分，天麻素注射液在临床上已用于脑血管病的治疗，其机制是发挥了持久的神经保护作用[11]。天麻素对脑缺血损伤、神经细胞修复等都有改善作用，其作用机制包括调节神经递质、抗炎和上调神经营养蛋白等[12,13]。研究显示，PDE9-c GMP-PKG信号通路参与脑缺血后神经干细胞（NSCs）的增殖，天麻素可抑制PDE9，激活c GMP-PKG，促进脑缺血后的神经再生[14]。天麻素还可以抑制小胶质细胞的激活，从而减轻缺血缺氧性脑损伤，其机制可能是抑制跨膜受体蛋白（Notch）途径和上调Sirtuin3(Sirt3)[15]。

BDNF对维持神经元正常功能有重要作用，还有营养、保护神经作用，能够修复受损伤的神经元，抑制凋亡，促进再生，对脑缺血后神经损伤的修复有明显作用[16]。研究显示，天麻素可上调BDNF，抑制促炎因子IL-6，保护神经元，减轻氧化应激和炎症反应，在治疗癫痫中具有协同卡马西平的疗效作用[17,18]。

天麻素可通过下调IL-6和IL-1β的表达水平，发挥抗炎效应，促进海马神经发生，从而发挥其抗抑郁作用[19]。本实验免疫组化和免疫印迹结果一致，天麻素治疗脑缺血可使缺血侧纹状体区Nissl阳性神经元数量增多，受损神经元数量减少，其机制可能是通过上调脑源性神经营养因子BDNF，下调促炎因子IL-6，从而发挥对神经元损伤的修复，调控神经炎性反应，发挥神经保护作用。

中医药已被广泛用于治疗脑卒中，它们通过复杂的脑缺血机制诱导多层次调节，改善神经功能障碍[20,21,22]。研究显示，中药丹参通过抑制小胶质细胞向M1型极化，降低促炎因子IL-6、IL-1β等的表达，减轻脑缺血大鼠的神经功能损伤[23]。脑缺血发病后小胶质细胞率先被激活，被激活的小胶质细兼有损伤和修复的潜能。具有经典激活的M1（促炎）和替代激活的M2（抗炎）两种表型。M1型小胶质细胞释放IL-6、IL-1β等促炎因子，加剧脑损伤；而M2型小胶质细胞释放BDNF、转化生长因子-β(TGF-β）等抗炎因子，促进炎症消退和神经修复[24,25]。本实验发现天麻素在治疗脑缺血中发挥了神经保护作用，推测可能是促使激活的小胶质细胞向M2型极化，抑制其向M1型极化，从而减轻脑损伤，促进神经修复。这可能是临床治疗脑缺血的一个潜在靶点。天麻素通过何种复杂的分子机制促使小胶质细胞从M1型向M2型极化，还需要进一步研究。

参考文献：

[8]产翠翠,马同军,王继胜,等.天麻素注射液通过NGF/TrkA通路减轻大鼠脑缺血所致肺损伤[J].南方医科大学学报, 2022, 42(1):116-122.

[11]北京脑血管病防治协会,天麻素制剂临床应用专家共识写作组,赵性泉,等.天麻素制剂临床应用中国专家共识(2021)[J].中华老年医学杂志, 2021, 40(4):407-415.

[17]薛莉,王鑫,李转会,等.天麻素联合卡马西平对癫痫患者氧化应激､炎性因子和脑源性神经营养因子的影响[J].神经损伤与功能重建, 2021, 16(12):777-779, 781.

[18]吴畏,李广鹏,张江波,等.天麻素联合地塞米松保护缺糖缺氧诱导的H9C2细胞损伤[J].中国临床药理学与治疗学, 2021, 26(11):1244-1249.

[19]孙润珠,周翠红,薛姗姗,等.天麻素对CUS大鼠抑郁样行为及IL-1β和IL-6水平的影[J].神经解剖学杂志, 2017, 33(2):221-224.

基金资助:安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2021A0851);皖南医学院校中青年重点项目(WK2021Z14);

文章来源:刘敏,丁艳霞,张业贵等.天麻素对脑缺血大鼠纹状体BDNF､IL-6表达的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(04):440-446.