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紫苏-乳香-没药挥发油对小鼠创口愈合的促进作用

2024-04-26 6 上传者：管理员

摘要：目的探讨紫苏挥发油与乳香-没药挥发油配伍对小鼠创口愈合的促进作用。方法将ICR小鼠随机分为空白组(CON)、模型组(MOD)、表皮生长因子凝胶组(GEL)、乳香-没药挥发油组(OM,50μL/mL)、紫苏-乳香-没药挥发油组(POM,70μL/mL,V(紫苏挥发油):V(乳香-没药挥发油)=2:5),除CON组外，其他各组在小鼠背部造一个直径0.8 cm的开放圆形创口。除MOD组外，每只小鼠涂药1次/d,连续14 d,观察小鼠创口愈合情况、病理组织形态，比较3、7、14 d小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达情况。结果 POM组小鼠创口愈合率大于OM组，且显著高于MOD组(P<0.05);组织病理学检查显示，POM组创口恢复情况优于MOD组；创后3 d, POM组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平显著低于MOD组(P<0.05)。结论紫苏-乳香-没药挥发油能减少创口前期炎症反应，促进小鼠创口愈合。

关键词：
乳香-没药
促透作用
创口愈合
活血散瘀
紫苏挥发油
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紫苏(Perilla frutescens L.)是我国传统药食两用植物，紫苏叶中的挥发油是其主要的活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化等药理活性[1],还有良好的解热镇痛效果[2]和促透作用[3]。乳香(Olibanum)为橄榄科植物乳香树的干燥树脂，是传统的常用中药，味苦、辛，性温，归心、肝、脾经，具行气活血、消肿生肌的功效[4,5]。没药(Myrrha)是橄榄科没药属及其同属植物的干燥树脂[6],味苦性平，归心、肝、脾经，具有活血定痛、消肿生肌的功效[7],还具有抗炎、镇痛等多种生物活性[8]。乳香、没药均为临床上常用的活血散瘀类药物，两者常配伍使用[9]。现代药理学研究[10]表明，乳香和没药合用具有抗炎镇痛的功效，说明两种药材合用具有良好的协同作用。刀口创伤是日常生活中常见的皮肤损伤形式，本研究将构建小鼠皮肤创伤模型，探讨紫苏叶挥发油与乳香-没药挥发油联合应用对创口愈合的促进作用。

1、材料与方法

1.1 材料与仪器

乳香、没药(河北美威药业股份有限公司);紫苏叶挥发油(北华大学药学院实验室自制);金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌、白念珠菌(吉林医药学院);重组人表皮生长因子凝胶(桂林华诺威基因药业有限公司);小鼠白细胞介素1β(IL-1β)酶联免疫分析试剂盒、小鼠白细胞介素6(IL-6)酶联免疫分析试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司);苏木素伊红(HE)染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司);多功能粉碎机(广州华凯电子科技有限公司);挥发油提取器(上海玻璃仪器厂);SPX-250B-Z恒温培养箱(上海博迅实业有限公司);石蜡包理机、冷台、RM2245半自动轮转式切片机(Leica公司，德国);BA400显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);IfiniteM200型酶标仪(TECAN公司，瑞士)。

1.2 试验方法

1.2.1 紫苏叶挥发油的抑菌活性

菌悬液制备：将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌及白念珠菌分别接种于肉汤培养基上，置于30 ℃培养箱内培养1 d, 用5 mL无菌水制成菌悬液。

采用抑菌圈法进行试验。分别取0.1 mL菌液均匀涂抹于培养基表面，37 ℃吸附30 min。正面放置沾取药物(豆油，10 μL/mL紫苏叶挥发油，20 μL/mL紫苏叶挥发油，50 μL/mL紫苏叶挥发油，75%乙醇，10 mg/mL注射用青霉素钠)的无菌滤纸片。37 ℃培养24 h, 测量抑菌圈直径。每组试验重复3次。

1.2.2 乳香-没药挥发油的最佳提取工艺筛选

分别将乳香、没药用粉碎机粉碎为粗颗粒，过12目筛，按m(乳香):m(没药)=1:1配比筛选最佳提取工艺条件。将药物粗颗粒置于2 000 mL圆底烧瓶中，水蒸气蒸馏法提取乳香-没药挥发油。影响挥发油提取率的主要因素有料液比(A)、浸泡时间(B)、提取时间(C),对A、B、C进行单因素-正交试验，以挥发油的提取率为考察指标，得到乳香-没药挥发油的最佳提取工艺。

确定乳香-没药挥发油最佳提取工艺后，根据乳香与没药在方剂中的常用配伍比例[11],将乳香、没药粗颗粒分别按1：1、1：2、2：1、2：3、3：2配比，并筛选出的最优提取条件，得到的挥发油用无水硫酸钠脱水后密封，于4 ℃保存。

1.2.3 乳香-没药挥发油促进小鼠伤口愈合的最佳配比筛选

ICR雄性小鼠适应性喂养1周后造模，随机分为7组，每组6只，分别为A组(乳香-没药1:1)、B组(乳香-没药1:2)、C组(乳香-没药2:1)、D组(乳香-没药2:3)、E组(乳香-没药3:2)、F组(重组人表皮生长因子凝胶)、G组(模型组)。使用乙醚呼吸麻醉小鼠，将每只小鼠背部毛发剃掉，75%酒精消毒，用剪刀在小鼠背部造直径0.8 cm的开放圆形创口。模型组不给药，F组每次涂抹给药0.1 g,A、B、C、D、E组均按V(挥发油):V(豆油)=5:95比例配制，每次涂抹给药100 μL,1次/d,连续给药14 d,期间小鼠单笼饲养，自由采食饮水。于造模后0、3、7、14 d拍摄创面情况，使用Image J扫描伤口面积，计算伤口愈合率：

1.2.4 紫苏-乳香-没药挥发油对小鼠伤口愈合的影响

选择1.2.3筛选出的乳香-没药比例提取挥发油进行试验。将雄性ICR小鼠分为5组，每组18只，分别为空白组(CON)、模型组(MOD)、表皮生长因子凝胶组(GEL)、乳香-没药挥发油组(OM,50 μL/mL)、紫苏-乳香-没药挥发油组(POM,70 μL/mL,V(紫苏挥发油):V(乳香-没药挥发油)=2:5),挥发油均用豆油配制。按1.2.3方法造模、给药并拍摄创面情况，计算伤口愈合率。造模后3、7、14 d,每组随机选择6只小鼠取血，静置1 h后3 500 r/min、4 ℃离心10 min;取血清，用ELISA法测定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量；14 d取小鼠创伤部位全层皮肤组织进行石蜡包埋和HE染色。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0对数据进行处理与统计学分析。数据以均数±标准差表示，用GraphPad Prism 8.0软件作图。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、试验结果

2.1 紫苏叶挥发油的抑菌活性结果

以抑菌圈≤5 mm判定药物对抑菌圈试验不敏感，即无抑制作用[12]。紫苏叶挥发油的抑菌作用见表1。由表1可知，10 μL/mL紫苏叶挥发油对金黄色葡萄球菌和伤寒沙门菌有一定抑制能力；20 μL/mL及50 μL/mL紫苏叶挥发油对各菌种均有较好的抑制能力，其抑菌能力与75%乙醇相当；10 mg/mL 注射用青霉素钠对绿脓杆菌和白念珠菌均无抑制作用；豆油对各菌种生长无抑制作用。后续选择20 μL/mL紫苏叶挥发油与乳香-没药挥发油配伍进行试验。

2.2 乳香-没药挥发油的最佳提取工艺结果

单因素-正交试验结果显示，RB>RC>RA,说明乳香-没药浸泡时间和提取时间是影响挥发油体积的主要因素，其次是加水量。结合各因素K值(加水倍数K值：K2>K1>K3,浸泡时间K值：K3>K2>K1,提取时间K值：K3>K2>K1)得出乳香-没药挥发油的最佳提取条件为7倍量水，浸泡60 min, 提取8 h, 见表2。

表1 紫苏叶挥发油的抑菌作用

表2 乳香-没药挥发油提取工艺正交结果

2.3 乳香-没药挥发油促进小鼠创口愈合的最佳配比筛选结果

本研究结果显示，与G组比较，A、C、F组小鼠创口愈合率显著增高(P<0.05),其中C组创口愈合率大于A组，因此认为，C组对创口愈合的效果更好，即m(乳香):m(没药)=2:1时为促进创口愈合的最佳配比，并按此配比提取挥发油进行后续试验，见表3。

表3 乳香-没药挥发油促进小鼠创面愈合结果

2.4 紫苏-乳香-没药挥发油对小鼠伤口愈合的影响

本研究结果显示，创后3 d, MOD组小鼠创口愈合率仅为12.37%,且创口表面出现渗出物；涂药组小鼠创口愈合率均显著高于MOD组(P<0.05),且创口干燥，未见明显渗出物，并出现小部分结痂。创后7 d, 各涂药组小鼠创口愈合率显著高于MOD组(P<0.05),所有组别小鼠创口均已经结痂，且POM组小鼠已开始出现结痂脱落现象。创后14 d, 小鼠创口基本愈合，POM组小鼠创口愈合率高于GEL组及OM组，且各给药组均显著高于MOD组(P<0.05);MOD组小鼠创口处存在未脱落的小块结痂，其余组别小鼠创口结痂均完全脱落，并长出新的皮肤组织，见图1、表4。

图1 小鼠创口愈合情况

表4 各组小鼠创口愈合率

创后14 d小鼠伤口处皮肤HE染色结果显示，CON组小鼠表皮细胞排列规则、结构紧密；与CON组比较，MOD组小鼠表皮角质层有明显增厚现象，并可见部分表皮细胞缺失；OM组表皮细胞增厚，GEL、POM组小鼠表皮细胞轻微增厚，结构完整，见图2。

图2 14 d小鼠皮肤组织HE染色结果

2.5 小鼠血清中炎症因子检测结果

小鼠血清中炎症因子检测结果显示，创后3 d, MOD组小鼠血清中3种炎症因子与空白组比较均显著升高(P<0.05);与MOD组比较，POM组小鼠血清中TNF-α、IL-6显著降低(P<0.05),OM组小鼠血清中IL-6显著降低(P<0.05)。创后7 d, MOD组小鼠血清中TNF-α与空白组比较显著升高(P<0.05);与MOD组比较，POM组小鼠血清中TNF-α显著降低(P<0.05),其余组数据比较差异无统计学意义(P>0.05)。炎症因子的检测结果说明，在伤口愈合3 d的炎症期，紫苏-乳香-没药挥发油联合应用可有效抑制炎症因子水平(P<0.05),而乳香-没药挥发油对炎症因子并无抑制作用(P>0.05);在伤口愈合7～14 d, 伤口已度过炎症期，因此各组小鼠血清中炎症因子比较差异无统计学意义(P>0.05),见图3。

刀伤属于急性伤口，愈合过程分为炎症期、增生期和重塑期3个阶段[13],一旦伤口愈合过程中受到其他因素干扰，易发生感染，伤口感染易使伤口停滞在炎症期，这是影响愈合的主要原因之一[14]。本研究中，乳香-没药挥发油虽有促进伤口愈合的作用，但在伤口愈合的炎症期并不能有效抑制炎症的发生。紫苏挥发油具有良好的抑菌作用，可有效避免创口发生细菌感染，缩短炎症期。因此，将紫苏挥发油与乳香-没药挥发油联用后，能有效抑制炎症因子水平，营造抑制细菌、有利于伤口愈合的皮肤表面微环境，进而提高伤口愈合能力。

图3 小鼠血清中炎症因子检测结果

3、结论

皮肤是人体最大的器官，也是保护人体的重要防卫屏障，在抵御细菌、真菌、病毒等方面具有至关重要的作用。当皮肤发生损伤时，机体会启动修复机制尽快修复伤口。伤口愈合是一个复杂工程，在这个过程中，感染、水肿、慢性疾病、营养不良等均会影响伤口愈合速度[11,12,13,14]。紫苏叶挥发油具有较好的抑菌活性。本研究结果显示，20 μL/mL的紫苏叶挥发油对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌及白念珠菌均有较好的抑制能力，这几种致病菌常存在于空气、地面及水中，伤口极易接触到，容易造成皮肤黏膜感染，影响伤口愈合速度。本研究表明，紫苏叶挥发油能够有效抑制上述致病菌，营造适合伤口愈合的皮肤表面微环境。

多种中医古籍名方中均有关于乳香、没药治疗伤损、镇痛的记载，两种药材均具有活血散瘀、生肌止痛的功效，常联合应用，如七厘散、活络效灵丹等方剂均应用了乳香、没药，具有活血散瘀、定痛止血的功效。本研究考察了不同配比下，乳香-没药挥发油对小鼠伤口愈合的影响，结果表明，当m(乳香):m(没药)=2:1时，提取获得的乳香-没药挥发油对小鼠创口愈合的促进作用最佳。

将紫苏挥发油与乳香-没药挥发油配伍使用后，小鼠创口愈合率显著增加，愈合速度提高，病理观察显示，创口附近表皮细胞结构完整，恢复效果较好。未涂药小鼠伤口恢复时出现感染，伤口周围有脓液渗出，而POM组小鼠并未出现感染化脓等现象。伤口处于炎症期时，POM组小鼠体内炎症因子水平与模型组相比显著降低(P<0.05),说明将紫苏叶挥发油与乳香-没药挥发油配伍使用可以有效降低炎症期时小鼠体内炎症因子水平，预防伤口感染。

本研究发现，紫苏叶挥发油具有良好的抑菌作用，m(乳香):m(没药)=2:1时，提取得到的挥发油具有最佳的促进伤口愈合作用，将紫苏叶挥发油与乳香-没药挥发油配伍使用，可抑制创口炎症期小鼠体内炎症因子水平，加快小鼠创口愈合速度。本研究验证了紫苏叶挥发油与乳香-没药挥发油联合应用的合理性与有效性，可为相关制剂开发提供理论依据。

参考文献:

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