首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 白血病论文 > METTL14在初诊急性髓系白血病患者中的表达及其临床意义

METTL14在初诊急性髓系白血病患者中的表达及其临床意义

2024-04-02 96 上传者：管理员

摘要：目的:通过检测RNA甲基转移酶样14(METTL14)在初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓中的表达水平，探讨METTL14表达在初诊AML患者中的临床与预后意义。方法:收集100例初诊AML患者骨髓标本作为AML组，60例缺铁性贫血(IDA)患者骨髓标本作为对照组，并收集AML患者的临床资料。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测METTL14在两组患者骨髓中的表达水平，并分析AML患者的METTL14表达水平高低与其临床病理特征及预后的关系。采用Kaplan-Meier曲线分析METTL14对AML患者总体生存时间(OS)的影响。通过Cox风险回归模型分析影响AML患者的预后因素。结果:与对照组相比，METTL14在AML患者中表达明显升高(P<0.05)。与低表达组比较，METTL14高表达组患者表现出高龄、高骨髓细胞数、疗效差及预后不良，差异具有统计学意义(P<0.05)。METTL14高表达组的OS较低表达组显著缩短(P<0.05)。METTL14高表达是影响AML预后的独立危险因素。结论:METTL14在AML患者中明显高表达，与较差的临床病理特征及不良预后相关，可作为判断AML患者预后的指标和潜在的治疗靶点。

关键词：
RNA甲基转移酶样14
临床意义
急性髓系白血病
恶性克隆增殖
造血系统
加入收藏

急性髓系白血病(AML)是造血系统最常见的恶性肿瘤，其特点是高度异质的造血干细胞和前体细胞的恶性克隆增殖，约占成人急性白血病的70%[1,2]。虽然随着临床诊断和治疗方法的不断改进，AML的预后已得到明显改善，但仍有约70%的患者确诊后生存不超过5年[3]。因此，寻找与AML的发生、发展及预后相关的生物标志物对AML患者的治疗具有重要意义。文献报道，N6-甲基腺苷 (m6A)修饰在多种癌症的发展中发挥多种作用，并参与其发病机制[4,5,6],METTL14 是 m6A 的“编写者”,目前有关 METTL14 在白血病中的研究很少。研究表明，METTL14在正常造血干细胞/祖细胞 (HSPC) 和 AML中表达水平增高，下调METTL14的表达可以促进 HSPC 和 AML 细胞的分化[7]。因此，本研究选择了100例初诊AML患者作为AML组，60名IDA患者作为对照组，分析METTL14在初诊AML中的表达以及其与患者临床特征和预后的相关性，从而明确METTL14能否作为AML的监测及治疗靶点。

一、材料和方法

病例资料

收集2018年12月至2021年12月蚌埠医学院第一附属医院血液内科100例AML患者和60例IDA患者的骨髓标本，所有AML均接受一个周期以上的化疗，且经过骨髓细胞学检测评估疗效。收集初诊AML的详细临床资料，如性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例、FAB分型、核型、基因突变、化疗方案、疗效判断和预后分层等。所有患者均签署了知情同意书，且本研究经蚌埠医学院第一附属人民医院伦理审查委员会批准。

试剂与仪器

TRIzol试剂、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、2X SG Fast qPCR预混液(低Rox)试剂盒及引物均购自上海生物工程公司。Applied Biosystems PCR仪购自赛默飞世尔科技公司。

RNA提取

骨髓血标本2 ml置于EDTa_K2管中，用2倍红细胞裂解液(NH4C1+NaHC03+EDTA-Na2O加蒸馏水再用标准酸碱调至pH 7.4)裂解红细胞，洗涤、离心2-3次，提取单个核细胞，保存在-80°C冰箱；将提取的单个核细胞解冻离心，加入200 μl TRIzol试剂、40 μl氯仿、100 μl异丙醇等提取总RNA,使用超微量分光光度计SMA1000测量总RNA的纯度与浓度，并收集OD260/280比值在1.8-2.0之间且浓度在30-70 ng/μl之间的总RNA样本。

METTL14表达水平的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测

按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生物工程公司)说明书反转录出cDNA,反应体系：2X SG Fast qPCR Master Mix (Low Rox) 10 μl, Forward Primer(10 μM) 0.4 μl, Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl, 样本cDNA 5 μl, DNF Buffer 2 μl, PCR-grade water 2 μl; 采用 SYBR green荧光染料法按照2X SG Fast qPCR预混液(低Rox)试剂盒(上海生物工程公司)说明书在PCR仪上扩增特定DNA片段，扩增条件：94 ℃ 10 min; 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环。每个样本均设置3个复孔进行对照，计算其均值，以β-actin作为内参基因，采用2-△△Ct 法计算METTL14基因的相对表达水平。各目的基因引物如下：METTL14上游引物：5’-GAGTGTGTTTACGAAAATGGGGT-3’,下游引物：5’-CCGTCTGTGCTACGCTTCA-3’; β-actin上游引物：5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’,下游引物：5’-AGGGCA-CGAAGGCTCATCATT-3’。

基因突变检测方法

将患者骨髓标本低温保存快速送至金域医学检验实验室，采用二代测序对AML 30个基因进行全外显子区域测序，包括单核苷酸变异、小片段插入/缺失，平均测序深度为2000×,测序仪为Illumina HiSeq X Ten测序仪(美国Illumina公司),主要包括以下环节：标本进行DNA提取，Rapid DNA Lib Prep Kit for Illumina(武汉爱博泰克公司)试剂盒构建含目标基因的全基因组文库制备、Illumina HiSeq X Ten测序仪进行靶向NGS测序，最后进行生信结果分析。

染色体检查方法

将骨髓标本送至合肥金域医学检验实验室进行染色体检查，方法为细胞培养G显带。具体操作：骨髓细胞经过 24 h 培养后收集细胞常规制片，将制好的染色体标本烤干后放入胰酶溶液中消化。然后置于Giemsa染液中染色，自来水冲洗干净，晾干后，即可阅片。镜检：在显微镜高倍目镜下检查显带标本，在染色体上若出现清晰的深浅相间的带型，即为可取标本。

疗效评定及随访

本研究中AML患者的诊断、分类、治疗方案及疗效评估均参照2021年中国AML治疗指南[8]。所有AML患者出院后均随访，末次随访时间为2022年12月31日。总生存期(OS)定义为AML患者从确诊日至随访终点的时间。

统计学分析

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料组间比较采用单样本t检验。为了分析METTL14与临床病理特征的相关性，根据所有AML患者的METTL14相对表达量的中位数，将患者分为METTL14高表达组和METTL14低表达组，高、低表达组的临床特征比较采用卡方(χ[2])检验或者Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法评估METTL14对患者总体生存时间(OS)的影响，采用Cox比例风险模型分析影响AML的预后因素，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

AML患者中METTL14的表达情况

通过qRT-PCR法检测METTL14在AML患者和IDA患者中的表达情况。结果显示，METTL14在AML组患者中的表达较对照组明显增高，差异具有统计学意义(t=7.568, P<0.01)(图1)。

METTL14的表达与AML患者临床病理特征之间的关系

分析METTL14与AML临床病理特征(性别、年龄、初诊白细胞计数、血红蛋白计数、血小板计数、骨髓原始细胞数、FAB分型)之间的相关性。结果显示，METTL14高表达组中年龄≥60岁患者明显多于低表达组(P=0.043),METTL14高表达组中高骨髓原始细胞数患者明显多于低表达组(P=0.046);而两组在性别、WBC计数、HB、PLT、白血病FAB分型上差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

AML患者<60岁患者选择伊达比星+阿糖胞苷(IA)方案化疗，部分50岁以上且小于60岁患者体能状态较差(ECOG>2分)也可选择去甲基化药物(HMA)±含Ara-C的联合方案；≥60岁患者选择使用去甲基化药物(HMA)±含Ara-C的联合方案，去甲基药物包括地西他滨(D)及阿扎胞苷(A);含Ara-C的方案包括D+HAG(高三尖杉酯碱+Ara-C+粒细胞刺激因子),A+HAG,D+Ara-C,A+Ara-C;其中接受IA方案有49例，接受HMA±Ara-C联合方案有51例。根据临床疗效评判标准，获完全缓解(CR)31例，部分缓解(PR)28例，未缓解(NR)41例。统计结果显示，METTL14高表达组NR病例数明显高于低表达组，差异具有统计学意义(P<0.05),而在化疗方案上差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

AML患者中，核型正常患者56例，核型异常患者44例，包括数目异常和结构异常；伴有CEBPA、NPM1、FLT3-ITD、NARS 或 KAR、DNMT3A、IDH1/2、ASXL1、SRSF2、TP53等基因突变的患者25例，其中8例患者存在≥3个基因同时突变，8例患者存在2个基因同时突变，4例患者单基因突变，无基因突变的患者75例。根据急性髓系白血病诊疗指南将患者分为预后良好组10例，预后中等组51例，预后不良组39例，结果显示：METTL14高表达组预后不良患者明显增多，较低表达组具有统计学差异(P<0.05),而在染色体核型及基因突变上差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

METTL14表达水平与AML患者预后的关系

为了阐明METTL14表达水平与AML患者预后的关系，采用Kaplan-Meier生存曲线分析100例AML患者的OS。结果显示，METTL14高表达患者的总体生存时间较低表达组明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2) 。提示，METTL14高表达可作为判断患者预后不良的潜在指标。

影响AML患者预后的多因素分析

将AML患者的临床资料如性别、年龄、FAB分型、骨髓原始细胞计数、WBC计数、Hb计数、PLT计数、化疗方案、染色体核型、预后风险分层及METTL14表达量等因素纳入多因素Cox风险回归模型中进行分析，结果显示：骨髓原始细胞数、WBC计数、PLT计数、预后分组及METTL14表达量是影响AML患者预后的独立危险因素(P<0.05)(表4)。

三、讨论

AML是一种高度异质性和致命性的肿瘤，由于复发率高，预后较差[9]。在真核生物中，m6A 是最常见的 mRNA 修饰形式[10];m6A修饰及其调节蛋白在各种癌症中发挥重要作用，包括白血病 [11,12]、脑肿瘤[13]、乳腺癌[14]和肺癌[15]。近年来关于m6A修饰模式在AML中作用的研究报道不少[16,17,18]。METTL14是m6A甲基化转移酶复合物的核心成分，参与m6A修饰的动态可逆过程。近年来METTL14在人类恶性肿瘤中的生物学功能受到越来越多人的关注。已有研究表明使用小分子METTL3抑制剂可以有效治疗AML[19]。最新研究也表明，METTL14与AML免疫浸润相关[20],有望成为AML的免疫治疗新靶点。

本研究结果显示，METTL14在AML中高表达，且METTL14高表达的患者总生存期(OS)明显缩短，与国外研究报道结果相同。本研究中METTL14在年龄≥60岁、高骨髓细胞数的AML中高表达，与其他研究中报道不同，可能与国内外关于METTL14在AML中的作用研究较少，或纳入病例数少相关。本研究结果还显示，AML患者表现出复杂染色体核型，且出现2个以上基因突变；且METTL14高表达的患者治疗后未缓解及预后不良比例高，较低表达患者有显著统计学意义(P=0.003,P=0.001),表明METTL14高表达的患者易出现化疗耐药性，疗效差，预后不良。多因素Cox回归分析结果显示，较高的骨髓原始细胞比例、发病时高WBC计数、低PLT计数、预后分组及METTL14表达量的高低是影响AML患者预后的风险因素。提示METTL14可用于预测AML的预后。

本研究也存在一定的局限性。首先，AML的FAB分型中M6及M7发病率极低，该研究未能纳入上述病例，应该收集更多的病例数进行对比，并增加不同亚型的病例数，为METTL14在不同亚型中的表达提供更有价值的参考信息。其次，此次纳入的患者大部分为老年患者，均未接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗，因此无法评估allo-HSCT是否能够敲除METTL14高表达的不良预后。因此，需要更多的AML样本量及纳入接受allo-HSCT治疗的患者进一步研究证实。

总之，本研究结果表明，METTL14 在AML患者中高表达，高水平的METTL14 与较短的生存期相关，METTL14高表达是AML患者预后不良的危险因素，可以作为临床上判断AML预后的指标，并有望探索其靶向治疗。

参考文献:

[8]中华医学会血液学分会白血病淋巴瘤学组.中国成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)诊疗指南(2021年版).中华血液学杂志,2021,42(8):617-623.

基金资助:安徽省自然科学基金青年项目(2108085QH324);安徽省卫生健康科研重点项目(AHWJ2023A10059);

文章来源:李佳佳,伍燕平,张孟孟,等.METTL14在初诊急性髓系白血病患者中的表达及其临床意义[J].中国实验血液学杂志,2024,32(02):376-381.