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摘要:目的:通过检测RNA甲基转移酶样14(METTL14)在初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓中的表达水平,探讨METTL14表达在初诊AML患者中的临床与预后意义。方法:收集100例初诊AML患者骨髓标本作为AML组,60例缺铁性贫血(IDA)患者骨髓标本作为对照组,并收集AML患者的临床资料。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测METTL14在两组患者骨髓中的表达水平,并分析AML患者的METTL14表达水平高低与其临床病理特征及预后的关系。采用Kaplan-Meier曲线分析METTL14对AML患者总体生存时间(OS)的影响。通过Cox风险回归模型分析影响AML患者的预后因素。结果:与对照组相比,METTL14在AML患者中表达明显升高(P<0.05)。与低表达组比较,METTL14高表达组患者表现出高龄、高骨髓细胞数、疗效差及预后不良,差异具有统计学意义(P<0.05)。METTL14高表达组的OS较低表达组显著缩短(P<0.05)。METTL14高表达是影响AML预后的独立危险因素。结论:METTL14在AML患者中明显高表达,与较差的临床病理特征及不良预后相关,可作为判断AML患者预后的指标和潜在的治疗靶点。
急性髓系白血病(AML)是造血系统最常见的恶性肿瘤,其特点是高度异质的造血干细胞和前体细胞的恶性克隆增殖,约占成人急性白血病的70%[1,2]。虽然随着临床诊断和治疗方法的不断改进,AML的预后已得到明显改善,但仍有约70%的患者确诊后生存不超过5年[3]。因此,寻找与AML的发生、发展及预后相关的生物标志物对AML患者的治疗具有重要意义。文献报道,N6-甲基腺苷 (m6A)修饰在多种癌症的发展中发挥多种作用,并参与其发病机制[4,5,6],METTL14 是 m6A 的“编写者”,目前有关 METTL14 在白血病中的研究很少。研究表明,METTL14在正常造血干细胞/祖细胞 (HSPC) 和 AML中表达水平增高,下调METTL14的表达可以促进 HSPC 和 AML 细胞的分化[7]。因此,本研究选择了100例初诊AML患者作为AML组,60名IDA患者作为对照组,分析METTL14在初诊AML中的表达以及其与患者临床特征和预后的相关性,从而明确METTL14能否作为AML的监测及治疗靶点。
一、材料和方法
病例资料
收集2018年12月至2021年12月蚌埠医学院第一附属医院血液内科100例AML患者和60例IDA患者的骨髓标本,所有AML均接受一个周期以上的化疗,且经过骨髓细胞学检测评估疗效。收集初诊AML的详细临床资料,如性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例、FAB分型、核型、基因突变、化疗方案、疗效判断和预后分层等。所有患者均签署了知情同意书,且本研究经蚌埠医学院第一附属人民医院伦理审查委员会批准。
试剂与仪器
TRIzol试剂、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、2X SG Fast qPCR预混液(低Rox)试剂盒及引物均购自上海生物工程公司。Applied Biosystems PCR仪购自赛默飞世尔科技公司。
RNA提取
骨髓血标本2 ml置于EDTa_K2管中,用2倍红细胞裂解液(NH4C1+NaHC03+EDTA-Na2O加蒸馏水再用标准酸碱调至pH 7.4)裂解红细胞,洗涤、离心2-3次,提取单个核细胞,保存在-80°C冰箱;将提取的单个核细胞解冻离心,加入200 μl TRIzol试剂、40 μl氯仿、100 μl异丙醇等提取总RNA,使用超微量分光光度计SMA1000测量总RNA的纯度与浓度,并收集OD260/280比值在1.8-2.0之间且浓度在30-70 ng/μl之间的总RNA样本。
METTL14表达水平的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测
按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生物工程公司)说明书反转录出cDNA,反应体系:2X SG Fast qPCR Master Mix (Low Rox) 10 μl, Forward Primer(10 μM) 0.4 μl, Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl, 样本cDNA 5 μl, DNF Buffer 2 μl, PCR-grade water 2 μl; 采用 SYBR green荧光染料法按照2X SG Fast qPCR预混液(低Rox)试剂盒(上海生物工程公司)说明书在PCR仪上扩增特定DNA片段,扩增条件:94 ℃ 10 min; 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环。每个样本均设置3个复孔进行对照,计算其均值,以β-actin作为内参基因,采用2-△△Ct 法计算METTL14基因的相对表达水平。各目的基因引物如下:METTL14上游引物:5’-GAGTGTGTTTACGAAAATGGGGT-3’,下游引物:5’-CCGTCTGTGCTACGCTTCA-3’; β-actin上游引物:5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’,下游引物:5’-AGGGCA-CGAAGGCTCATCATT-3’。
基因突变检测方法
将患者骨髓标本低温保存快速送至金域医学检验实验室,采用二代测序对AML 30个基因进行全外显子区域测序,包括单核苷酸变异、小片段插入/缺失,平均测序深度为2000×,测序仪为Illumina HiSeq X Ten测序仪(美国Illumina公司),主要包括以下环节:标本进行DNA提取,Rapid DNA Lib Prep Kit for Illumina(武汉爱博泰克公司)试剂盒构建含目标基因的全基因组文库制备、Illumina HiSeq X Ten测序仪进行靶向NGS测序,最后进行生信结果分析。
染色体检查方法
将骨髓标本送至合肥金域医学检验实验室进行染色体检查,方法为细胞培养G显带。具体操作:骨髓细胞经过 24 h 培养后收集细胞常规制片,将制好的染色体标本烤干后放入胰酶溶液中消化。然后置于Giemsa染液中染色,自来水冲洗干净,晾干后,即可阅片。镜检:在显微镜高倍目镜下检查显带标本,在染色体上若出现清晰的深浅相间的带型,即为可取标本。
疗效评定及随访
本研究中AML患者的诊断、分类、治疗方案及疗效评估均参照2021年中国AML治疗指南[8]。所有AML患者出院后均随访,末次随访时间为2022年12月31日。总生存期(OS)定义为AML患者从确诊日至随访终点的时间。
统计学分析
应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料组间比较采用单样本t检验。为了分析METTL14与临床病理特征的相关性,根据所有AML患者的METTL14相对表达量的中位数,将患者分为METTL14高表达组和METTL14低表达组,高、低表达组的临床特征比较采用卡方(χ[2])检验或者Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法评估METTL14对患者总体生存时间(OS)的影响,采用Cox比例风险模型分析影响AML的预后因素,P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
AML患者中METTL14的表达情况
通过qRT-PCR法检测METTL14在AML患者和IDA患者中的表达情况。结果显示,METTL14在AML组患者中的表达较对照组明显增高,差异具有统计学意义(t=7.568, P<0.01)(图1)。
METTL14的表达与AML患者临床病理特征之间的关系
分析METTL14与AML临床病理特征(性别、年龄、初诊白细胞计数、血红蛋白计数、血小板计数、骨髓原始细胞数、FAB分型)之间的相关性。结果显示,METTL14高表达组中年龄≥60岁患者明显多于低表达组(P=0.043),METTL14高表达组中高骨髓原始细胞数患者明显多于低表达组(P=0.046);而两组在性别、WBC计数、HB、PLT、白血病FAB分型上差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。
AML患者<60岁患者选择伊达比星+阿糖胞苷(IA)方案化疗,部分50岁以上且小于60岁患者体能状态较差(ECOG>2分)也可选择去甲基化药物(HMA)±含Ara-C的联合方案;≥60岁患者选择使用去甲基化药物(HMA)±含Ara-C的联合方案,去甲基药物包括地西他滨(D)及阿扎胞苷(A);含Ara-C的方案包括D+HAG(高三尖杉酯碱+Ara-C+粒细胞刺激因子),A+HAG,D+Ara-C,A+Ara-C;其中接受IA方案有49例,接受HMA±Ara-C联合方案有51例。根据临床疗效评判标准,获完全缓解(CR)31例,部分缓解(PR)28例,未缓解(NR)41例。统计结果显示,METTL14高表达组NR病例数明显高于低表达组,差异具有统计学意义(P<0.05),而在化疗方案上差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。
AML患者中,核型正常患者56例,核型异常患者44例,包括数目异常和结构异常;伴有CEBPA、NPM1、FLT3-ITD、NARS 或 KAR、DNMT3A、IDH1/2、ASXL1、SRSF2、TP53等基因突变的患者25例,其中8例患者存在≥3个基因同时突变,8例患者存在2个基因同时突变,4例患者单基因突变,无基因突变的患者75例。根据急性髓系白血病诊疗指南将患者分为预后良好组10例,预后中等组51例,预后不良组39例,结果显示:METTL14高表达组预后不良患者明显增多,较低表达组具有统计学差异(P<0.05),而在染色体核型及基因突变上差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。
METTL14表达水平与AML患者预后的关系
为了阐明METTL14表达水平与AML患者预后的关系,采用Kaplan-Meier生存曲线分析100例AML患者的OS。结果显示,METTL14高表达患者的总体生存时间较低表达组明显缩短,差异具有统计学意义(P<0.05)(图2) 。提示,METTL14高表达可作为判断患者预后不良的潜在指标。
影响AML患者预后的多因素分析
将AML患者的临床资料如性别、年龄、FAB分型、骨髓原始细胞计数、WBC计数、Hb计数、PLT计数、化疗方案、染色体核型、预后风险分层及METTL14表达量等因素纳入多因素Cox风险回归模型中进行分析,结果显示:骨髓原始细胞数、WBC计数、PLT计数、预后分组及METTL14表达量是影响AML患者预后的独立危险因素(P<0.05)(表4)。
三、讨论
AML是一种高度异质性和致命性的肿瘤,由于复发率高,预后较差[9]。在真核生物中,m6A 是最常见的 mRNA 修饰形式[10];m6A修饰及其调节蛋白在各种癌症中发挥重要作用,包括白血病 [11,12]、脑肿瘤[13]、乳腺癌[14]和肺癌[15]。近年来关于m6A修饰模式在AML中作用的研究报道不少[16,17,18]。METTL14是m6A甲基化转移酶复合物的核心成分,参与m6A修饰的动态可逆过程。近年来METTL14在人类恶性肿瘤中的生物学功能受到越来越多人的关注。已有研究表明使用小分子METTL3抑制剂可以有效治疗AML[19]。最新研究也表明,METTL14与AML免疫浸润相关[20],有望成为AML的免疫治疗新靶点。
本研究结果显示,METTL14在AML中高表达,且METTL14高表达的患者总生存期(OS)明显缩短,与国外研究报道结果相同。本研究中METTL14在年龄≥60岁、高骨髓细胞数的AML中高表达,与其他研究中报道不同,可能与国内外关于METTL14在AML中的作用研究较少,或纳入病例数少相关。本研究结果还显示,AML患者表现出复杂染色体核型,且出现2个以上基因突变;且METTL14高表达的患者治疗后未缓解及预后不良比例高,较低表达患者有显著统计学意义(P=0.003,P=0.001),表明METTL14高表达的患者易出现化疗耐药性,疗效差,预后不良。多因素Cox回归分析结果显示,较高的骨髓原始细胞比例、发病时高WBC计数、低PLT计数、预后分组及METTL14表达量的高低是影响AML患者预后的风险因素。提示METTL14可用于预测AML的预后。
本研究也存在一定的局限性。首先,AML的FAB分型中M6及M7发病率极低,该研究未能纳入上述病例,应该收集更多的病例数进行对比,并增加不同亚型的病例数,为METTL14在不同亚型中的表达提供更有价值的参考信息。其次,此次纳入的患者大部分为老年患者,均未接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗,因此无法评估allo-HSCT是否能够敲除METTL14高表达的不良预后。因此,需要更多的AML样本量及纳入接受allo-HSCT治疗的患者进一步研究证实。
总之,本研究结果表明,METTL14 在AML患者中高表达,高水平的METTL14 与较短的生存期相关,METTL14高表达是AML患者预后不良的危险因素,可以作为临床上判断AML预后的指标,并有望探索其靶向治疗。
参考文献:
[8]中华医学会血液学分会白血病淋巴瘤学组.中国成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)诊疗指南(2021年版).中华血液学杂志,2021,42(8):617-623.
基金资助:安徽省自然科学基金青年项目(2108085QH324);安徽省卫生健康科研重点项目(AHWJ2023A10059);
文章来源:李佳佳,伍燕平,张孟孟,等.METTL14在初诊急性髓系白血病患者中的表达及其临床意义[J].中国实验血液学杂志,2024,32(02):376-381.
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急性髓系白血病(AML)属于血液内科的常见病。根据流行病学的调查研究[1]结果显示,近年来我国AML的患病率呈攀升趋势,且已成为儿童最为常见的恶性肿瘤。目前临床上以化疗作为AML患儿的首选治疗手段,能有效提高患儿的生存率。
2024-07-11急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)在成人中发病率较高,其发病机制目前尚未完全明确,可能与病毒感染、遗传、化学物质刺激等因素有关,主要来源于髓系造血干祖细胞,发病后将会侵犯骨髓、血液及周边正常组织,对患者生命安全威胁较大。尽管部分患者可通过化疗缓解病情,但70%左右的患者缓解后极易出现复发的情况。
2024-07-10慢性髓细胞性白血病(CML)常被称为慢性粒细胞白血病,其特征是染色体 t(9;22)(q34;q11)形成费城(Ph)染色体和BCR-ABL1融合基因。CML在儿童中相对罕见,占所有儿童白血病的2%~3%,在18岁以下的CML患儿中,发病的中位年龄为10~12岁[1]。随着酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的出现,TKI逐渐取代造血干细胞移植治疗成为CML的一线治疗方法[2]。
2024-06-17白血病是一类以异常造血细胞恶性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血细胞减少为特征的疾病,发病率在肿瘤疾病中居第6位[1]。其中,急性粒-单核细胞白血病是由粒细胞和单核细胞系同时发生恶性增生所导致的急性白血病,其发病人数约占急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)发病人数的15%[2]。该病发病诱因多而复杂,且目前的治疗药物价格昂贵、副作用大,治疗预后不佳[3]。
2024-06-14慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)是一种淋巴增殖性疾病,发病人群大多为老年人,近年来发病率呈逐渐增长的趋势[1,2]。程序性死亡受体(programmed cell death1,PD-1,CD279)可以参与机体肿瘤的免疫逃逸,因此研究PD-1免疫抑制剂,对CLL进行免疫治疗具有重要意义。PD-1与受体PD-L1结合后,可诱导T细胞失活或凋亡,使机体的抗肿瘤作用显著下降[3,4,5,6]。
2024-06-05急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种血液系统恶性肿瘤,具有高度特异性,多发于中老年人群中,由于老年患者自身年龄较大,多伴有基础性疾病,器官功能处于退化状态,对于化疗治疗耐受度较差,再加上疾病自身即存在较高的不良细胞遗传学频率,分子性改变等,导致患者的治疗难度增加,整体预后较差[1]。
2024-06-04急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种髓系造血干细胞或者祖细胞的恶性疾病,占儿童急性白血病的15%~20%,柔红霉素(daunorubicin, DNR)是治疗AML的一线用药,尽管大部分患儿经DNR治疗实现了初始诱导缓解,但化学治疗耐药仍是治疗失败的关键因素。因此,探寻儿童AML化疗耐药的潜在机制和治疗新策略尤为重要[1]。
2024-05-31急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种髓系造血干细胞或者祖细胞的恶性疾病,占儿童急性白血病的15%~20%,柔红霉素(daunorubicin, DNR)是治疗AML的一线用药,尽管大部分患儿经DNR治疗实现了初始诱导缓解,但化学治疗耐药仍是治疗失败的关键因素。因此,探寻儿童AML化疗耐药的潜在机制和治疗新策略尤为重要[1]。
2024-05-30急性白血病(acute leukemia,AL)是一种具有克隆性和侵袭性的造血系统恶性肿瘤。研究显示,随着现代诊疗技术的不断发展,AL患者5年生存率显著提高,但该病仍难以治愈,患者需要承受生理困扰、情绪障碍等压力,普遍存在自我感受负担和支持性护理需求。既往研究表明,成年AL患者焦虑发生率为50.70%,抑郁发生率为43.70%。
2024-05-22急性白血病(acute leukemia,AL)是一种具有克隆性和侵袭性的造血系统恶性肿瘤[1]。研究[2]显示,随着现代诊疗技术的不断发展,AL患者5年生存率显著提高,但该病仍难以治愈,患者需要承受生理困扰、情绪障碍等压力,普遍存在自我感受负担和支持性护理需求。既往研究[3]表明,成年AL患者焦虑发生率为50.70%,抑郁发生率为43.70%,患者的抑郁水平与家庭韧性呈负相关。家庭韧性是家庭面对逆境或压力时帮助家庭从危机中恢复的一种特质和属性[4]。
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期刊名称:白血病•淋巴瘤
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主管单位:国家卫生健康委员会
主办单位:中华医学会,山西省肿瘤研究所,陕西省肿瘤医院
出版地方:山西
专业分类:医学
国际刊号:1009-9921
国内刊号:11-5356/R
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创刊时间:1992年
发行周期:月刊
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