鼻咽癌(NPC)为发生在鼻咽上皮内壁的头颈部高发恶性肿瘤，发病率具有明显的地域倾向和种族差异，在中国南方、北非和东南亚发病率较高[1]。我国传统中医药在治疗NPC患者方面有独特优势，和单纯放疗相比，中西医结合疗法能有效改善NPC患者口腔黏膜不良反应、胃肠道不良反应及唾液腺损伤情况等，并能有效提高患者生活质量[2]。益气解毒方是本课题组研究和应用了二十几年的经验方，为田道法教授等针对NPC的“气虚染毒”的中医病机，根据“益气解毒，生津润燥”立法研制，课题组前期研究[3,4]已验证益气解毒方可以有效抑制NPC细胞增殖。益气解毒方中苯丙素类化合物来自党参异欧前胡素(isoimperatorin)及君药黄连中阿魏酸(ferulicacid)、绿原酸(chlorogenicacid)，已有研究发现这几类中药单体具有镇痛抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性，对多种肿瘤细胞株具有抑增殖促凋亡效应[5,6,7,8]。

为了进一步佐证益气解毒方中苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸对人离体NPC细胞株增殖效应的影响及机制，本研究通过实时无标记细胞功能分析技术(RTCA)、CytationTM5细胞成像实时监测、Westernblot等分别从整体效应、形态变化及蛋白质表达水平探讨这些中药单体对NPCCNE2细胞增殖效应作用，进一步阐明益气解毒方的药效发挥机制。

1、材料

1.1细胞株

人NPC细胞株CNE2(BNCC341794），购于北京北纳创联生物技术研究院，由本实验室传代培养。

1.2药物与试剂

异欧前胡素（质量分数≥98%,20180522）、阿魏酸（质量分数≥98%,20160519）、绿原酸（质量分数≥98%,20180311）均购自上海金穗生物科技有限公司；抗体β-actin(3700S）、XIAP(14334P）、Survivin(2808S）均购自美国CST公司；PCNA抗体（bs-0754R,北京博奥森生物技术有限公司）；IRDye680RD羊抗鼠二抗（C70417-02）、IRDye800CW羊抗兔二抗（C70420-01）均购自美国LI-COR公司；RPMI-1640培养基（AE29163437）、PBS缓冲液（SH30256.01B）均购自美国HyClone公司；青霉素-链霉素溶液（WH01112004XP）、含0.25%EDTA胰蛋白酶溶液（WH01122008XP）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（42A0378K）购自美国Gibco公司。

1.3实验仪器

双人单面洁净工作台（SJ-CJ-2FD,苏州苏洁净化设备有限公司）；二氧化碳细胞培养箱（CCL-170B-8，新加坡ESCO公司）；医用离心机（L535R,湖南湘仪实验室仪器开发公司）；倒置相差生物显微镜（AE31，麦克奥迪实业集团有限公司）；实时无标记细胞分析仪（RTCADP,美国ACEA公司）；多功能微孔板检测系统（CytationTM5，美国BioTek公司）；红外荧光扫描成像系统（ODYSSEYCLx，美国LI-COR公司）。

2、方法

2.1细胞培养

使用含有10%的胎牛血清、100kU/L青霉素、0.1g/L链霉素的RPMI-1640培养基培养CNE2细胞，置于37℃、5%CO2及湿度饱和的培养箱中培养，适时换液，每2～3d传代1次。

2.2实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)监测细胞增殖

取3块RTCA检测专用E-plate板，每孔各加入50μL培养基，置于仪器中测量基线、平衡仪器。取对数生长期的CNE2细胞，37℃胰酶消化2min，制成单细胞悬液，将细胞混匀后接种于E-plate板中，每孔100μL细胞悬液，控制细胞密度为5000个/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每组设5个复孔。实验分组：每个药物分别设对照组和1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L共7组。接种后培养约12h，细胞贴壁生长，弃去原培养液，每孔加入200μL含药培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，RTCA持续监测72h以上[7,8]。RTCA监测系统可通过自动计算细胞指数(cellindex,CI)反映细胞增殖情况，CI=(Rn-Rb)/15，其中，Rn表示孔接种细胞后的电极阻抗值，Rb为背景阻抗基线值，进而绘制出细胞生长曲线。根据加药后24、36、48、60、72h的均一化细胞指数，计算药物相对增殖率，增殖率=（实验组均一化细胞指数/对照组均一化细胞指数）×100%。

2.3CytationTM5多功能细胞成像微孔板检测系统监测细胞形态

取对数生长期的CNE2细胞，37℃胰酶消化2min，制成单细胞悬液，每孔100μL细胞悬液接种于96孔培养板中，控制细胞密度为5000个/孔，细胞贴壁生长，弃去原培养液，每孔加入200μL含药培养基或含溶剂培养基，实验分组：对照组、异欧前胡素组、阿魏酸组、绿原酸组，药物组浓度均为20μmol/L。将96孔板放置于CytationTM5检测系统中37℃、5%CO2继续培养48h，设定每6h进行一次全板自动图像捕获及分析细胞形态图像，监测细胞生长形态。

2.4Westernblot检测蛋白表达

取对数生长期的CNE2细胞，传代至细胞培养皿中，细胞贴壁生长后弃去原培养液，加入含药培养基或含溶剂培养基，实验分组同“2.3”，置于37℃、5%CO2继续培养36h后提取总蛋白并进行BCA定量，取50μg蛋白配置上样体系。根据检测蛋白分子量配置合适浓度的分离胶和浓缩胶，上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭。按照一定稀释比例稀释β-actin、PCNA、XIAP和Survivin,4℃过夜孵育，TBST洗涤3次，每次10min，再加入相对应的鼠二抗或兔二抗，室温孵育2h,TBST洗涤3次，每次10min，于ODYSSEYCLx红外荧光扫描成像系统上扫描显影，检测不同处理组间目的条带的信号值，计算相对表达量。

2.5统计学分析

所有实验数据均采用SPSS23.0统计软件进行统计学分析，使用GraphPadPrism8软件进行统计图的绘制，实验数据均采用“”表示。两组间数据比较使用独立样本T检验方法。各组间计量资料数据比较使用单因素方差分析方法分析，方差齐使用LSD检验进行多重比较，方差不齐使用Dunnett’T3多重检验。

3、结果

3.1益气解毒方中苯丙素类化合物对CNE2细胞增殖的影响

异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸均能不同程度地抑制CNE2细胞增殖，呈现出药物浓度越高抑制效应越明显的趋势，同一药物作用时间点，3种中药单体的半数抑制浓度(medianinhibitionconcentration,IC50)不同。药物作用36h后异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸的IC50分别为33.05、87.07、33.88μmol/L。且这3种苯丙素类化合物抑制率出现明显拐点均出现在加药后36h左右。见表1和图1-3。

表1不同化合物不同时间点的IC50值

图1不同浓度异欧前胡素处理后CNE2细胞增殖曲线

图2不同浓度阿魏酸处理下CNE2细胞增殖曲线

图3不同浓度绿原酸处理下CNE2细胞增殖曲线

3.2益气解毒方中苯丙素类化合物对CNE2细胞形态的影响

与对照组饱满均匀，细胞结构完整的CNE2细胞形态相比，异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸处理后的大量细胞出现细胞膜破溃，细胞结构模糊等形态变化。与对照组相比异欧前胡素、阿魏酸处理的CNE2细胞抑制增殖的效应更显著，加药处理36h后细胞增殖速度减慢并伴有大量细胞脱壁漂浮，细胞核固缩碎裂变形，胞内容物外翻等形态变化，绿原酸则是加药处理48h后出现明显形态变化。见图4。

3.3益气解毒方中苯丙素类化合物对CNE2细胞增殖相关蛋白的影响

与对照组相比，加药组的细胞增殖相关蛋白PCNA及细胞生存蛋白Survivin、凋亡抑制蛋白XIAP表达量均不同程度的降低，且差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见图5。

图4益气解毒方主要苯丙素类化合物对CNE2细胞形态的影响（比例尺=100μm，×200)

图5益气解毒方主要苯丙素类化合物对NPCCNE2细胞增殖相关蛋白的影响（x±s,n=3)

4、讨论

NPC的发生发展是一个多步骤、多因素的过程，发病机制复杂，包括EB病毒(EBV)感染[9]、人乳头瘤病毒感染[10,11]、遗传易感性[12]等。NPC患者的早诊断早治疗，提高晚期NPC患者的生存率及改善其生活质量仍是NPC研究学者们关注的主要问题。已有大量前期研究[13,14,15,16,17]围绕益气解毒方对NPC细胞增殖、凋亡、自噬、迁移的作用和机制，益气解毒方由黄芪、党参、黄连、天花粉、白花蛇舌草、茯苓、甘草组成，体外能通过下调端粒酶的活性抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，还可能通过抑制细胞内重要的核转录因子、细胞分裂增殖、细胞周期、DNA修复和诱导细胞凋亡、促进坏死等信号通路，从而抑制细胞增殖和诱导细胞死亡，体内可抑制裸鼠NPC移植瘤的形成等[8,18,19]。

益气解毒方中主要含有三萜类化合物和苯丙素类化合物，如槲皮黄素、山柰酚、芒柄花黄素、黄连素、茯苓酸、黄芪甲苷、异欧前胡素、绿原酸、熊果酸、齐墩果酸、汉黄芩素、小檗碱、阿魏酸等成分[20]。课题组前期研究[21]发现益气解毒方中三萜类化合物齐墩果酸、熊果酸、黄芪甲苷及茯苓酸对NPCCNE2细胞增殖效应的作用，证实其可以抑制CNE2细胞增殖。本研究主要比较益气解毒方苯丙素类化合物。异欧前胡素对多种肿瘤细胞株具有抑增殖促凋亡效应[3,4]。阿魏酸可通过抑制肿瘤细胞能量代谢、发挥直接细胞毒作用、诱导细胞凋亡等起到抗癌作用[22]。同样有大量研究发现绿原酸可在多种肿瘤中发挥抑制作用[5,23,24]。为了进一步探讨益气解毒方中苯丙素类化合物是否抑制了NPCCNE2细胞的增殖，三者之间效应有何不同，本研究通过监测细胞增殖曲线、形态改变及增殖相关蛋白质水平表达差异等方式进行研究。

RTCA通过监测E-plate板孔内电阻抗变化，分析得出的CI可以揭示细胞增殖、死亡、迁移等行为，有利于精确指导和改进实验设计。CytationTM5多功能细胞成像微孔板检测系统可实时监测细胞形态并拍照记录，对活细胞进行动态监测与多维分析。PCNA是一个重要的细胞增殖相关蛋白，其可以在复制叉处协调大部分代谢反应，包括DNA复制和DNA修复等，还可以通过表皮生长因子受体(EGFR)在酪氨酸211(Y211)上的磷酸化修饰，PCNA过度表达及活化与多种癌症发生发展有关[25]。凋亡抑制因子XIAP和细胞生存蛋白Survivin均可介导细胞增殖。本实验通过RTCA监测发现异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸均能不同程度地抑制CNE2细胞增殖，并且呈现出药物浓度越高抑制效应越明显的趋势，不同药物单体发挥最佳药效的时间不同，3种苯丙素类化合物抑制率出现明显拐点均出现在加药后36h左右。药物作用36h后异欧前胡素、阿魏酸、绿原酸的IC50分别为33.05、87.07、33.88μmol/L。CytationTM5实时监测结果显示，对照组CNE2细胞形态饱满均匀，细胞结构完整，异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸处理后的大量细胞出现细胞膜破溃，细胞结构模糊，细胞脱壁漂浮等形态异常变化。与对照组相比，加药组的PCNA、XIAP及Survivin蛋白表达均下调，且差异具有统计学意义（P<0.05）。

综上，本研究表明，益气解毒方中苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸可以抑制人NPCCNE2细胞增殖。异欧前胡素抑制增殖效应出现较慢，但出现形态异常时间较早，且抑制增殖效应较明显；绿原酸虽出现抑制增殖效应较早，抑制增殖效应较弱一些；阿魏酸抑制增殖效应及出现形态异常较早，但抑制增殖效应为三者中最弱。3种苯丙素类化合物均可损伤NPCCNE2细胞，使其细胞形态发生改变。异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸抑制NPCCNE2细胞增殖作用可能通过下调PCNA、XIAP及Survivin表达来完成。本研究对益气解毒方中苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸抑制NPCCNE2细胞增殖效应情况进行比较，并且对其机制进行初步研究，揭示益气解毒方的药效物质基础，明确益气解毒方单体有效作用成分，丰富益气解毒方应用于临床的科学理论依据，更好的指导临床用药。今后的实验将探索益气解毒方内主要苯丙素类化合物异欧前胡素、阿魏酸及绿原酸抑制NPCCNE2细胞增殖的更多分子机制。

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文章来源：熊雨,刘洁,邹攀,苏芮,钟文良,江志超,王贤文,何迎春.益气解毒方中苯丙素类化合物对鼻咽癌细胞增殖效应的影响[J].湖南中医药大学学报,2021,41(05):701-706.

基金：国家自然科学基金项目(81973914,81874408);湖南省自然科学基金项目(2019JJ40216,2018JJ2219)