子痫前期（preeclampsia,PE）是一种孕妇特有的疾病，主要症状是高血压、蛋白尿、水肿，有可能伴随其他器官功能障碍，严重威胁母婴健康，其发病机制尚未明确，终止妊娠仍是PE的唯一根本治疗方法[1]。因此，探究PE的发病机制受到越来越多的关注。自噬是一种重要的细胞过程，通过这种机制，细胞能够自我降解并清除一些不需要的或受损的细胞成分，有助于维持细胞内部环境的稳定[2,3]。自噬功能的异常与神经退行性病变、肿瘤和代谢性疾病等多种疾病密切相关。研究[4]发现，自噬功能障碍可能是这些疾病发生发展过程中的一个重要因素，提示进一步研究自噬在疾病发病机制中的作用的重要性。近年来，越来越多的医务工作者及科研人员对自噬在PE发生发展中的作用感兴趣[3,5,6]。已有研究表明，在PE中，绒毛膜外滋养层侵袭能力和血管重塑都呈上升趋势，同时滋养层细胞的自噬水平也在增加。这些变化可能与胎儿生长受限、妊娠期高血压等疾病有关，但具体的发病机制尚未被完全揭示。Micro RNAs(mi RNAs）是一种小分子非编码RNA[7]，参与自噬、侵袭迁移、增殖等多种生物学功能[7,8]。近年来研究[8,9,10,11,12,13,14]表明，在PE中，有多种不同表达的mi RNA，它们影响着胎盘滋养细胞的形态和功能[15]，参与PE的发生。课题组在前期收集人胎盘组织，测序发现mi R-15a-5p在胎盘组织具有差异性表达[16]，但其在PE发生进展中的功能机制尚不明确。因此，本研究以人胎盘组织和体外培养的胎盘滋养细胞为主要研究对象，通过模拟PE发生发展的病理环境的实验方法，研究体外缺氧诱导滋养细胞发生自噬机理，以研究mi R-15a-5p在PE胎盘滋养细胞自噬中的作用和可能机制。

1、材料与方法

1.1胎盘组织

收集2020年12月至2022年12月的正常妊娠胎盘组织（PC组）和子痫前期胎盘组织（PE组）各20例，结果显示，PE组与PC组在多个方面存在明显差异。具体而言，PE组患者平均年龄较年轻，孕周较短，而其收缩压和舒张压明显偏高，并且蛋白尿呈阳性。相比之下，PC组患者的年龄较大，孕周较长，血压水平较低，且蛋白尿呈阴性。PE组在收缩压、舒张压以及24 h蛋白尿方面显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。在孕周和年龄方面的差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。在进行剖宫产术后1 h内，我们在胎盘母面距离脐带2 cm处随机选取3个部位分别取下1块胎盘组织，用0.9%Na Cl清洗后冻存于-80℃冰箱。该项目已获宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（宁医大伦理号第2020-427号），所有标本采集者均签署了知情同意书。纳入标准：患有妊娠期高血压的单胎妊娠，剖宫产患者；排除标准：多胎妊娠，合并心血管、内分泌、自身免疫性疾病，以及胎儿及胎盘结构异常等。

表1研究对象临床资料分析 

1.2实验试剂

人源胎盘滋养细胞株（HTR8-S/Vneo）购自中国上海复旦细胞库。mi R-15a-5p、mi R-15a-5p inhibit及mi R-15a-5p、U6引物均购自广州锐博；胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Gi Bco；逆转录试剂盒、q RT-PCR试剂盒均购自日本Ta Ka Ra；总RNA提取试剂盒购自北京天根；青链霉素、胰蛋白酶消化液购自北京solarbio；总蛋白提取试剂盒购自上海凯基；Anti-LC3B兔抗人一抗购自美国abcam,ab192890;Anti-p62兔抗人一抗购自美国abcam,ab207305;β-actin购自美国Santa,sc-47778;YAP1引物由北京擎科（西安分公司）合成；人ACTB内参引物购自上海生工。

1.3实验仪器

CO2培养箱（美国，Thermo）；组织研磨机（中国，FLUKO）；电泳仪、电转仪、凝胶成像仪（美国，Bio-rad），超净工作台（中国，Heal Force）；荧光定量PCR仪（德国，Analytik Jena）；酶标仪（北京德泉兴业商贸有限公司）；BS110S型精密天平（德国，Sartorius）；高速冷冻离心机（德国，Eppendorf）。

1.4细胞分组

将HTR8-S/Vneo细胞分正常组（control组）和缺氧组（hypoxia组），观察缺氧对mi R-15a-5p表达的影响。另设mimic-NC组、mimicNC+hypoxia组、mi R-15a-5p mimic组、mi R-15a-5p mimic+hypoxia、inhibitor-NC组、inhibitor-NC+hypoxia、mi R-15a-5p inhibitor组、mi R-15a-5p inhibitor+hypoxia组，观察mi R-15a-5p对缺氧诱导的滋养细胞自噬相关蛋白LC3B和p62的影响。

1.5细胞培养及转染

(1）细胞培养：将HTR8-S/Vneo复苏，加入5 m L提前配好的RPMI 1640培养基，在细胞培养箱内进行培养，每隔24 h进行换液，显微镜下观察细胞融合度达到80%～90%时，用1 m L 0.25%的含酚红、EDTA胰蛋白酶消化液予以消化传代，收集对数生长期的细胞备用。

(2）细胞转染：待细胞密度达到培养瓶底面积60%～70%时，按Lipofectamine 2000说明书进行转染，将mi R-15a-5p inhibit-NC、mi R-15a-5p mimicNC、mi R-15a-5p mimic及mi R-15a-5p inhibit分别转染至HTR-8/Svneo细胞，6 h后换液，转染24 h后进行后续研究。

1.6 q RT-PCR测定胎盘组织和滋养细胞中mi R-15a-5p及YAP1的表达

提取各组的总RNA，检测mi R-15a-5p及YAP1的表达，紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。按照反转录试剂盒说明书，以m RNA作为模板，将引物序列利用逆转录酶反转录成c DNA，再以c DNA为模板进行PCR扩增。YAP1上游引物序列：5′-TAGCCCTGCGTAGCCAG-TTA-3′，下游引物序列5′-TCATGCTTAGTCCACT-GTCTGT-3′.mi R-15a-5p上游引物序列：TAGCAGC-CATAATGGTTTGTG下游引物序列：CTCAACTG-GTGCGTGGA。mi R-15a-5p PCR的热反应条件为：95.0℃30 s;95.0℃5 s、60℃34 s,39个循环，YAP1 PCR的热反应条件为：95.0℃30 s;95.0℃5 s、57.5℃34 s,39个循环。结果以2-ΔΔCt法计算。

1.7 Western blot检测自噬相关蛋白LC3B和p62表达水平

加入蛋白裂解液提取1.4中各组蛋白，BCA法蛋白定量，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，再用配置好的PBST液进行洗膜，洗3次，每次10 min。将膜放在配置好的特异性一抗孵育盒：p62(1∶2 000）、LC3B(1∶2 000）及β-actin(1∶1 000），在4℃恒温箱中孵育过夜。PBST洗膜3次，每次10 min。放置在山羊抗兔（1∶5 000）抗体中室温孵育2 h，再一次用PBST进行洗膜3次，每次10 min。然后利用电化学发光技术对蛋白信号进行可视化和定量分析。对目的蛋白的灰度值进行统计分析。实验均重复3次。

1.8统计学方法

在本研究中，每个实验至少重复3次，以确保数据的可靠性和稳定性。所有数据均以的形式表示。mi R-15a-5p与PE临床特征相关性分析采用pearson相关系数，统计分析采用Prism8.0软件，两组间的差异采用了独立样本t检验进行比较，多组间的两两比较则运用了单因素方差分析方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 mi R-15a-5p在胎盘组织和滋养细胞中的表达情况

q RT-PCR检测发现，与PC组相比，PE组胎盘组织中mi R-15a-5p表达显著升高（P<0.01）；与control组比较，mi R-15a-5p在hypoxia组中表达显著升高（P<0.01）。见图1。

图1 q RT-PCR检测mi R-15a-5p在PE胎盘组织和滋养细胞中的表达 

2.2 mi R-15a-5p表达水平及其与研究对象临床特征的关联分析

为进一步确定mi R-15a-5p与PE的相关性，将mi R-15a-5p的表达水平与研究对象的临床特征进行Pearson相关性分析（图2），结果显示：mi R-15a-5p表达水平与收缩压（r=0.625 0）、舒张压（r=0.611 9）均呈正相关（P<0.000 1）。提示mi R-15a-5p可能参与了PE的发生发展。

2.3过表达/干扰mi R-15a-5p在胎盘滋养细胞中的表达

在HTR-8/Svneo细胞中转染mi R-15a-5p mimic和inhibitor，采用q RT-PCR检测mi R-15a-5p的转染效率，见图3。

2.4 mi R-15a-5p对胎盘滋养细胞自噬的影响

过表达mi R-15a-5p后，与control组相比，hypoxia组中胎盘滋养细胞LC3BⅡ/Ⅰ表达显著增加（P<0.01),p62蛋白表达减低（P<0.01），细胞自噬水平显著上升；相反，在抑制miR-15a-5p后，hypoxia组中的胎盘滋养细胞LC3BⅡ/Ⅰ表达减少（P<0.01),p62蛋白表达升高（P<0.01），细胞自噬水平降低。见图4。

图2 mi R-15a-5p的表达水平与临床特征的相关性分析  

图3转染mi R-15a-5p mimic和inhibitor后mi R-15a-5p的表达 

2.5通过生物信息软件分析发现，YAP1可能是mi R-15a-5p的靶基因

Target Scan网站预测分析的结果显示，YAP1与mi R-15a-5p有结合位点，见图5。

在研究中发现，mi R-15a-5p对YAP1 m RNA和蛋白的表达起着调控作用。为了验证这一发现，研究中采用了q RT-PCR和Western blot两种技术来检测表达水平。实验结果表明，与NC组相比，抑制mi R-15a-5p后，YAP1 m RNA的表达显著增高（P<0.01),YAP1蛋白的表达水平亦升高（P<0.01）。

2.6 YAP1 mi RNA在PE胎盘组织和滋养细胞中的表达

q RT-PCR检测胎盘组织和滋养细胞中YAP1 mi RNA的表达水平，检测结果发现与PC组相比，PE组中的YAP1 mi RNA的表达降低（P<0.01）；与control组相比，hypoxia组中YAP1 mi RNA的表达也是降低的（P<0.01）。见图6。

图4转染mi R-15a-5p mimic和inhibitor后胎盘滋养细胞中LC3B和p62蛋白的表达  

2.7 YAP1蛋白在PE胎盘组织和胎盘滋养细胞中的表达

Western blot检测YAP1蛋白在PE胎盘组织和滋胎盘养细胞中的表达，结果显示，与PC组相比，PE组中YAP1蛋白的表达是明显降低的（P<0.01）；与control组相比，hypoxia组中YAP1蛋白的表达量也是显著降低（P<0.01）。见图7。

3、讨论

PE长期以来被认为是一种异质性疾病，其发病机制涉及多个基因和因素，胎盘在整个PE的产生过程中起关键性角色[17]。滋养细胞是构成胎盘的主要成分，胎盘保持正常的生理功能的前提是滋养细胞有正常的结构和功能[14,18]。研究[19]表明滋养细胞入侵不足引发子宫螺旋动脉重建功能障碍和浅胎盘着床，这会导致胎盘缺血缺氧以及滋养细胞的过度自噬。细胞自噬过程其实是细胞内自降解，是蛋白质快速分解的过程[20]，其特征是机体在营养不足期间对蛋白质或细胞质成分进行广泛的降解，这在哺乳动物的胚胎发育和胎盘植入中是必要的，一旦胎盘中在自噬水平发生紊乱，会产生可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1），其被释放后会导致母体血管受损[21]。因此，滋养细胞中自噬水平的改变和调节备受关注。

图5 YAP1与mi R-15a-5p的预测结合位点及敲低mi R-15a-5p后YAP1的表达变化

图6 q RT-PCR检测YAP1在PE胎盘组织和滋养细胞中的表达 

图7 Western blot检测YAP1在PE胎盘组织和滋养细胞中的表达  

mi RNA是种小的单链和非编码的分子，mi RNA的基因表达调控功能在不同疾病的病理过程中发挥重要作用。已有研究表明mi RNA在PE的病理生理学中具有重要作用[22],mi R-30-5p介导的滋养层铁脱落与子痫前期的发病机制有关[23],mi R-146a-5p介导的子痫前期滋养细胞进展和上皮-间质转化的抑制[24]，由此可见，mi RNA参与PE的多种生理病理改变。mi R-15a-5p作为抑癌基因已受到广泛的重视，血浆来源的外泌体mi R-15a-5p已经成为了早期检测子宫内膜癌的最有前景的诊断性生物标志[25]，而滋养细胞作为类癌细胞，具有癌细胞习性，本研究发现mi R-15a-5p在PE组织和滋养细胞中表达明显升高，Peason分析结果显示mi R-15a-5p与PE患者的收缩压和舒张压呈正相关。为了进一步研究mi R-15a-5p对PE自噬的影响，进行过表达和干扰mi R-15a-5p，与mi R-15a-5p mimic NC组相比，mi R-15a-5p mimic+hypoxia组滋养细胞中LC3BⅡ/Ⅰ表达增高，P62蛋白相对表达量降低；与mi R-15a-5p inhibitor NC组相比mi R-15a-5p inhibitor+hypoxia组滋养细胞中LC3BⅡ/Ⅰ表达量降低，P62蛋白表达量升高；发现干扰mi R-15a-5p对滋养细胞自噬具有负调控作用。

在过去的几十年里，大量的研究报道了mi RNA通过靶向关键基因可作为疾病进展和转移的调节因子。生物信息学分析预测YAP1是mi R-15a-5p的潜在靶点。同时，与mi R-15a-5p inhibitor NC组相比，mi R-15a-5p inhibitor组中YAP1的表达是增高的。YAP1作为癌基因，其主要负责调控细胞稳态、组织大小、再生和肿瘤发生，而且许多肿瘤的细胞生长、存活和肿瘤发生都取决于YAP1的持续表达[26,27]。q RT-PCR及Western blot检测结果发现YAP1在PE胎盘组织和缺氧诱导的胎盘滋养细胞中表达均下调，这与mi R-15a-5p在PE胎盘组织和缺氧诱导的胎盘滋养细胞中的表达水平相反，提示mi R-15a-5p可能通过与YAP1结合发挥作用。

综上所述，在PE患者中，mi R-15a-5p的表达水平上调，而YAP1的表达水平下降。此外，当mi R-15a-5p被敲低时，YAP1的表达量则呈现出上升趋势。这些结果表明，mi R-15a-5p可能会通过靶向YAP1的方式来促进胎盘滋养细胞的自噬作用，从而促进PE的发病进程。本研究成果为PE发生机理的探讨带来新的探索方向，并为临床预防及早期诊疗PE提供重要的理论依据。

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文章来源:于素美,张玉月,马丽文,等.miR-15a-5p对子痫前期胎盘滋养细胞自噬的影响[J].实用医学杂志,2024,40(12):1631-1636.