创面愈合是一个复杂但有序的过程，包括止血、炎症、增殖和皮肤重塑4个阶段[1]。基于间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的治疗因其招募细胞和释放生长因子和蛋白质的能力显示出巨大的创面愈合潜力，尤其是脂肪来源的MSCs(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)[2]。ADSCs具有更高的增殖能力和更晚的衰老以及更强的细胞分裂能力，是治疗慢性创面的理想干细胞，在免疫调节、血管新生重建、皮肤创面愈合和组织再生中起作用，但仍存在缺乏标准化的剂量或分离方案、免疫排斥、代谢障碍以及干细胞的染色体变异等问题[3]。

ADSCs分泌的外泌体（exosomes,Exos）避免了免疫排斥和肿瘤发生的风险，参与包括炎症、血管生成、细胞增殖等生物学过程，调控创面修复过程[4]。Exos作为载体携带生物活性分子，包括蛋白质、复合物和非编码RNA(nc RNA）等，参与细胞间通讯和物质交换。nc RNA主要分为长链非编码RNA(lnc RNA）、micro RNA(mi RNA）和环状RNA(circ RNA），被认为是Exos的有效成分。这些序列不编码蛋白质，而是在基因表达的转录协调和转录后调控中起调节作用。Exos递送的nc RNA已被证明在靶细胞中介导重要的表型效应，因此它们可以作为创面愈合中新的治疗靶点[5]。本文重点综述ADSC-Exo-lnc RNA/mi RNA/circ RNA在创面愈合过程中的作用研究进展，以期探讨作为创面治疗新策略的可能性。

1、外泌体的特征和功能

Exos是直径约为30～150 nm的细胞外囊泡，存在于体液中，包括尿液、血浆、脑脊液、乳汁和唾液，并可由多种哺乳动物细胞类型分泌，包括MSCs、癌细胞、免疫细胞和神经元[6]。Exos生物发生涉及三个主要步骤：内吞囊泡通过质膜内陷产生，通过内体膜向内出芽形成多泡体（MVBs），当MVBs与质膜融合时，Exos从细胞中释放或直接从质膜释放分泌，参与细胞间通讯[7]。Exos富含多种生物活性分子，包括蛋白质、信使RNA(m RNA）、转运RNA(t RNA）和nc RNA如lnc RNA、mi RNA、circ RNA[8]。由于独特的脂质双层结构，Exos保护内容物不被降解，将DNA、nc RNA等生物活性物质从亲代细胞传递到受体细胞，进一步介导细胞间通讯[9]。已有研究证明，MSCs来源的Exos继承了干细胞的治疗潜力，可通过有效调控免疫炎症反应、细胞增殖、迁移和血管生成，促进创面愈合[10]。

2、脂肪间充质干细胞外泌体

来源于MSCs的Exos由于含有不同的遗传物质与蛋白质参与创面修复，特别是ADSC-Exos递送的nc RNA可能通过多种机制参与创面愈合过程[11]。脂肪组织基质血管部分中含有丰富的AD-SCs，具有无需侵入性程序即可轻松提取、增加丰度及快速扩增、自我更新和多向分化能力、免疫原性低以及优异的旁分泌潜能的优势[12]。Exos继承了ADSCs的部分功能和生物学特征，可通过调控创面中的炎症反应、血管生成、细胞增殖和再上皮化等多种途径促进创面愈合，同时避免了ADSCs直接移植面临的感染、致瘤、栓塞等风险。与其他MSCs类型相比，ADSCs可以分泌更多的Exos[13]。ADSC-Exos有望成为创面愈合的新策略，但具体机制有待进一步研究。

3、脂肪间充质干细胞外泌体lnc RNA在创面愈合中作用

Lnc RNA长度超过200个核苷酸，不能编码蛋白质，但可以通过表观遗传、转录和转录后修饰来调节基因表达[14]。目前研究更多关注lnc RNA作为调节mi RNA的竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA,ce RNA），减少参与创面愈合的m RNA降解[15]。研究表明ADSC-Exos包含多种lnc RNA，包括H19、Linc00511和lnc RNA MALAT1等，可以转移到皮肤成分细胞中，介导靶基因和蛋白表达水平的改变，参与炎症和免疫反应、血管新生、再上皮化和细胞外基质重塑促进创面愈合[11]。

3.1调节炎症和免疫反应

炎症期决定了创面的愈合过程，创面中巨噬细胞极化抗炎细胞M2表型失调及过量促炎性细胞因子的表达导致慢性创面[16]。因此，良好的炎症调节保证了创面愈合。研究证明lnc RNA如CASC2、GAS5、Ftx和SOX2OT可靶向mi RNA参与创面愈合的炎症反应[17-20]。Lnc RNA CASC2下调mi R-144表达，靶向上调细胞因子信号传导抑制因子2(Suppressor of cytokine signaling 2,SOCS2）表达进一步抑制IL-1β和TNF-α等炎症因子的释放从而缓解炎症。同样发现Lnc RNA GAS5竞争结合mi R-520-3p靶向上调SOCS3表达，减少炎症因子释放进而抑制脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的巨噬细胞炎症反应。Lnc RNA Ftx抑制mi R-382-5p表达水平促进神经调节素-1(Neuregulin-1,Nrg1）表达，减少炎症因子并改善炎症。lnc RNA SOX2OT通过抑制mi R-215-5p表达，上调细胞间粘附分子1(Intercellular adhesion molecule 1,ICAM1）促进LPS诱导的炎症损伤。此外，MSC-Exos通过lnc RNA H19降低促炎因子IL-1β和TNF-α水平，升高抗炎因子IL-10水平，改善创面炎症[21]。进一步研究发现，AD-SC-Exos的lnc RNA H19通过促进巨噬细胞M2极化，靶向mi R-130b-3p/PPARγ/STAT3轴从而减弱炎症加速创面愈合[22]。然而，关于ADSC-Exos的lnc RNA在调节创面炎症的相关研究仍较少，需要深入探索。

3.2血管新生

创面愈合在很大程度上依赖于血管形成、血管生成和提供必要的氧气供应来刺激修复和新生血管[23]。血管生成涉及局部微血管内皮细胞（ECs）的激活。在缺氧的创面环境下，ECs通过促血管生成信号如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）和血管生成素来生成血管[24]。近来研究表明ADSC-Exo-lnc RNA参与血管生成。Sun等人验证了ADSC-Exos中的早期生长反应因子-1(Early growth response factor-1,EGR-1）显著促进人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的增殖、迁移和血管生成，加速创面愈合，这与lnc RNA-SENCR/DKC1/VEGF-A轴有关[25]。此外，在Qiu等人[26]的研究中，过表达Linc00511的ADSC-Exos通过抑制内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）中黄体酮和脂肪q受体家族成员3(PAQR3）抑制Twist1的泛素化和降解，从而上调Twist1的表达，恢复EPCs的生物学能力，加速血管形成，从而促进创面愈合。

3.3再上皮化

在增殖期，成纤维细胞增殖产生细胞外基质（ECM），同时上皮细胞向创面中心迁移以促进创面愈合[1]。研究表明ADSC-Exo-lnc RNA可以调控创面中的成纤维细胞促进创面愈合。过量表达H19的ADSC-Exos抑制mi R-19b水平，上调SOX9，从而激活Wnt/β-catenin信号通路,促进成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭,加速再上皮化[11]。Zhu等人发现ADSC-Exos负载的XIST通过XIST/mi R-96-5p/DDR2促进小鼠真皮成纤维细胞的增殖和迁移，促进创面愈合[27]。研究还发现ADSC-Exos释放的MALAT1增加成纤维细胞迁移，加速创面愈合[28]。进一步研究发现含有MALAT1的ADSC-Exos可以通过靶向mi R-124并激活Wnt/β-catenin通路促进成纤维细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡[29]。另一项研究也表明ADSC-Exos转运的MALAT1通过靶向mi R-378a增加FGF2水平促进成纤维细胞增殖和迁移，加速再上皮化[30]。

3.4细胞外基质重塑

创面重塑是愈合过程的最后阶段，在此期间，瘢痕的程度由合成和降解的ECM的数量决定[31]。增生性瘢痕（HS）是创面愈合的病理反应，其特征是成纤维细胞的异常增殖和胶原蛋白的过度沉积[32]。ADSC-Exos通过激活ERK/MAPK通路，增加Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原、TGF-β3/TGF-β1、MMP3/TIMP1的比例，从而阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，抑制瘢痕形成[33]。研究表明Lnc RNA8975-1在增生性瘢痕成纤维细胞中上调并控制胶原蛋白表达[34]。此外，lnc RNA H19敲低抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移、侵袭和ECM沉积[35]。进一步研究发现lnc RNAH19通过mi R-196b-5p上调SMAD家族成员5表达来加重瘢痕疙瘩进展。

4、脂肪间充质干细胞外泌体micro RNA在创面愈合中作用

Mi RNA是一类长度为17-24个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因的3′-非翻译区（3′-UTR）相互作用导致m RNA降解或翻译抑制[36]。Mi RNA通过控制皮肤细胞的增殖、分化和凋亡，在创面愈合中起着关键的调节作用[37]。Mi RNA可以封装在Exos中，由Exos携带并释放到靶细胞或组织中。基于Exos的mi RNA传递可能比基于血浆的mi RNA传递更有效，避免生物活性降低以及低酸性p H值和Rnase介导的降解[38]。ADSC-Exos含有丰富的mi RNA，包括mi RNA-10a、mi RNA-21、mi R-NA-31、mi R-126-5p、mi RNA-451a、mi RNA-125a、mi R-106a-5p、mi R-144-3p、mi R-210、mi R-486-5p、mi R-423-5p和mi R-126-3p等。在创面愈合过程中，它们参与调节炎症反应、血管生成和稳态、ECM生成和再上皮化，已被证明在调节创面愈合的进展中起着关键作用。

4.1免疫调节和炎症反应

ADSC-Exos可以作为有效的免疫调节剂和理想的递送miRNA的载体，调节免疫反应和炎症反应。负载mi R-10a的AD-SC-Exos促进Th17和Treg从初始CD4+T细胞分化，IL-17、TGF-β的分泌水平升高，IFN-γ的分泌水平降低，加强了免疫反应，促进创面愈合[39]。基于高通量测序，Wang等人发现，与未经处理的ADSC-Exos相比，经缺氧预处理的ADSC-Exos中的215个mi RNA上调，369个mi RNA下调。与常氧相比，缺氧诱导后的ADSCs显示出增强的旁分泌效应，分泌的Exos的治疗效果显著增强。缺氧预处理的ADSC-Exos中mi R-21-3p/mi R-126-5p/mi R-31-5p的上调和mi R-99b/mi R-146-a的下调通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(AKT）信号通路抑制炎症因子的释放，促进糖尿病创面愈合[40]。

4.2血管新生

ADSC-Exo-miRNA可直接影响或间接在基因表达，蛋白水平上促进血管生成加速创面愈合。ADSC-Exos的mi RNA-31、mi R-423-5p和mi RNA-125a已经被证实可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移、诱导血管生成加速创面愈合[41-43]。除了直接促进血管生成外，有大量研究表明ADSC-Exos通过mi RNA促进高水平的血管生成细胞因子和生长因子分泌来促进血管生成。来自ADSC-Exos，特别是来自缺氧ADSC-Exos，通过mi R-21靶向下调磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）激活PI3K/AKT通路促进M2极化，增强缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α）和VEGF的表达来促血管生成[44]。经mmu＿circ＿0001052修饰的ADSC-Exos通过mi R-106a-5p和FGF4/p38MAPK途径，增强FGF4和VEGF的表达促进血管生成[45]。来自缺氧预处理ADSC-Exos的circ-Snhg11通过激活mi R-144-3p/HIF-1α/VEGF信号通路促进血管生成，从而促进创面愈合[46]。此外，ADSC-Exos释放的mi R-132和mi R-146a上调促血管生成基因如血管生成素1(ANGPT1）和flk1(KDR）的表达，降低抗血管生成基因如血管生成抑制蛋白1(VASH1）和血小板反应蛋白-1(THBS1）的表达，从而增加血管生成[47]。高表达mmu＿circ＿0000250的ADSC-Exos靶向mi R-128-3p上调沉默信息调节因子1(SIRT1）表达促进创面血管生成[48]。

4.3促进细胞增殖

ADSC-Exo-mi RNA可以通过信号通路调节成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移。Mi RNA微阵列分析显示，促进真皮成纤维细胞增殖和分化的ADSC-Exos中有292个mi RNA发生改变，其中199个表达上调，93个下调[49]。Choi等人发现ADSC-Exos通过抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的mi RNA，与皮肤再生相关的基因如Ⅰ型胶原蛋白和角质形成细胞生长因子（KGF）的表达增加，促进真皮成纤维细胞的增殖和分化，从而有助于皮肤成纤维细胞的再生[49]。研究表明mi RNA-146a修饰的ADSC-Exos通过上调丝氨酸家族H成员1(SERPINH1）和磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK），促进成纤维细胞增殖和迁移[26]。此外，ADSC-Exos的mi R126-3p过表达抑制PIK3R2，促进成纤维细胞的增殖迁移和减少细胞凋亡从而提高大鼠皮肤缺损的创面愈合率[50]。研究表明mi R-378在ADSC-Exos中含量丰富，可靶向半胱天冬酶-3(caspase-3）降低角质形成细胞细胞的氧化应激损伤[51]。过表达mi RNA21的ADSC-Exos通过PI3K/AKT通路增加MMP-9的表达，从而增强Ha Ca T细胞的迁移和增殖[52]。

4.4抑制瘢痕增生

ADSC-Exo-mi RNA可调节胶原重塑，抑制瘢痕增生。早期，Exos通过合成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原促进胶原重塑，而晚期通过抑制胶原形成来减少瘢痕形成[53]。研究显示ADSC-Exos中高表达的mi RNA-21可以通过PI3K/AKT途径增加MMP-9和MMP-3蛋白的表达，抑制TIMP-1和TIMP-2蛋白的表达[52]。在组织重塑阶段，肌成纤维细胞的出现也是必不可少的。然而，在成人创伤愈合过程中，肌成纤维细胞的过度分化会导致创面形成纤维化瘢痕[54]。ADSC-Exo-mi RNA可调节成纤维细胞中基因表达，阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化减少瘢痕的形成。Li等人发现ADSC-Exos中的mi R-192-5p靶向下调成纤维细胞中IL-17RA的表达，调节Smad通路减少胶原沉积，抑制肌成纤维细胞活性，减轻增生性瘢痕纤维化[55]。同时，研究发现经mi R-29a修饰的ADSC-Exos通过抑制TGF-β2/Smad3信号通路，阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，减少过度的瘢痕形成[56]。

5、脂肪间充质干细胞外泌体circ RNA在创面愈合中作用

Circ RNA是一种单链的内源性非编码RNA，通过共价闭合构成了独特的环状结构，具有性质稳定、表达量丰足、高度保守、细胞特异性、组织特异性等特点。Circ RNA可以充当mi RNA海绵或ce RNA，与其他RNA竞争mi RNA配对，还可以调节细胞核中的转录以及与蛋白质因子结合[57]。一项研究通过高通量基因测序比较了慢性难治性创面和正常皮肤组织中circ RNA和mi RNA的差异表达，发现糖尿病患者创面组织与正常组织基因表达差异较大，在356个差异表达的circ RNA中157个上调和199个下调，在42个差异表达的mi RNA中2个上调和40个下调，为进一步探究其在创面愈合过程中的作用提供了重要证据[58]。

ADSC-Exos通过递送circ RNA在创面愈合过程发挥重要作用。来自缺氧预处理ADSC-Exos的circ-Snhg11可通过调控mi R-144–3p/HIF-1α/STAT3信号通路促进M2型巨噬细胞极化。结果还证实，circ-Snhg11通过激活mi R-144-3p/HIF-1α/VEGF信号通路增加EPCs的血管分化功能，促进糖尿病创面愈合[46]。另一项研究发现，富含circ-Astn1的ADSC-Exos抑制EPCs中mi R-138-5p的表达并促进SIRT1表达和抑制叉头转录因子O1(forkhead box O1,Fox O1）表达，抑制细胞凋亡恢复EPCs功能，从而促进血管生成加速创面愈合[59]。文献报道ADSC-Exos中的circ RNAs在EPCs的增殖、迁移中发挥作用，此外还可通过调控血管内皮细胞促进血管生成因子如VEGF、FGF、血小板衍生生长因子（PDGF）等表达促进创面愈合。在缺氧预处理的ADSC-Exos中高表达的circ-Gcap14通过抑制下游mi R-18a-5p和促进HIF-1α在小鼠创面模型中的表达，增加血管生成生长因子的表达并加速创面愈合[60]。ADSC-Exos中的mmu＿circ＿0001052通过减少mi R-106a-5p，升高FGF4和VEGF，激活p38MAPK途径促进创面血管生成[45]。然而，ADSC-Exos中的circ RNA在创面愈合中的确切作用及其机制在很大程度上仍未完全阐明。

6、总结与展望

创面尤其是慢性创面目前仍然是临床面临的巨大挑战。创面愈合受炎症、细胞增殖、血管生成和ECM重塑的影响。nc RNA可以调节这些过程以促进创面愈合。由于高生物相容性和低毒性，ADSC-Exos作为理想载体递送nc RNA，表现出显著的稳定性和更持久的活性，更容易转移到靶细胞中发挥功能促进创面愈合。

目前关于外泌体nc RNA的研究仍然面临一些挑战：（1)Exos的分离效率和质量仍不理想。由于年龄、样品采集、制备或储存等因素导致细胞裂解或RNA降解所获得的蛋白质和RNA含量存在显著差异，因此必须对Exos分离方法进行标准化[61]。（2)Exos在细胞间特异选择性传递生物活性分子介导细胞间通讯。然而，分子是如何合成并选择性地包装到Exos中，需要进一步的研究来揭示其具体机制。（3)ADSC-Exos中特异性nc RNA所处的局部微环境会影响其生物学效应的发挥，功效可能受到来自亲代细胞的非特异性nc RNA、杂质和细胞碎片影响[62]。（4)Exos可以被设计成递送系统传递nc RNA到靶细胞用于治疗。但外泌体nc RNA在临床转化前仍有许多实际问题需要解决，包括给药途径、生物分布、安全性、生物学功能、有效剂量和治疗窗口期等。

在基因治疗中，针对Exos被设计成递送系统传递特异性nc RNA，由于游离Exos被快速清除[63],Exos与生物材料的结合将成为基因治疗的主要焦点。最近研究表明，包裹在PF-127水凝胶中的ADSC-Exos被缓慢释放促进创面愈合，该组合具有控制递送，持续释放Exos和减少给药频率的优点[64]。Jiang等人[65]将ADSC-Exos加载到基质金属蛋白酶可降解PEG(MMP-PEG）智能水凝胶中，该水凝胶可以通过响应MMP刺激反应释放Exos，通过Akt信号增强细胞功能，同时缓解H2O2诱导的氧化应激，加速创面愈合。此外，近年来，一种基于红细胞膜的纳米药物靶向递送系统[66]因其具有出色的靶向性和免疫逃逸能力，为静脉注射的不足提供了解决方案。目前关于AD-SC-Exo-nc RNA在创面愈合应用的研究可能只是冰山一角，但该治疗策略在创面愈合中前景广阔。

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基金资助:国家自然科学基金(81460293);

文章来源:刘丽桦,刘德伍.脂肪间充质干细胞外泌体源非编码RNA在创面愈合中的作用[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(09):1049-1056.