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水蛭对ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠自噬的影响

2024-03-15 8 上传者：管理员

摘要：目的探讨水蛭对动脉粥样硬化小鼠自噬的影响。方法将40只健康雄性ApoE-/-小鼠随机均分为模型组、对照组(3×10-3 g·kg-1·d-1辛伐他汀)及低、中、高剂量实验组(0.45、0.9、1.8 g·kg-1·d-1脉血康胶囊),8只健康雄性C57BL/6J小鼠为空白组。给予普通饲料适应性喂养1周后，除空白组外，其余各组采用高脂饲料喂养8周建立动脉粥样硬化小鼠模型，之后按照设定剂量灌胃给药，每日1次，连续给药12周，期间继续给予高脂饲料饮食。用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平；用蛋白质印迹法检测Beclin-1、LC3自噬蛋白水平。结果高、中、低剂量实验组和对照组、模型组、空白组的IL-6含量分别为(107.59±3.03)、(99.31±5.12)、(103.52±2.28)、(98.68±4.68)、(112.66±6.08)和(93.98±3.43)pg·mL-1,TNF-α含量分别为(538.41±30.26)、(504.49±21.51)、(538.51±19.05)、(494.05±25.08)、(578.53±26.32)和(467.35±21.53)pg·mL-1,模型组的上述指标与实验组、对照组和空白组相比，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。高、中、低剂量实验组和对照组、模型组的Beclin-1蛋白表达水平分别为1.48±0.05、1.72±0.05、1.19±0.02、1.51±0.04和0.66±0.03,LC3Ⅱ蛋白表达水平分别为1.53±0.01、1.83±0.02、1.16±0.01、1.90±0.01和0.49±0.01,模型组的上述指标与低、中、高实验组和对照组相比，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论水蛭可能通过调节斑块内细胞自噬水平，从而达到抗动脉粥样硬化的作用。

关键词：
ApoE-/-小鼠
动脉粥样硬化
水蛭
炎症因子
自噬
血脂
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动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是影响全世界人民的最大健康问题之一[1]。现代医学认为[2],炎症反应对动脉粥样硬化的形成发挥关键作用。自噬是维持细胞和机体能量平衡的代谢过程，主要是通过吞噬包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解内容物，以实现细胞本身代谢需要及更新[3]。研究表明，自噬与心血管疾病密切相关，尤其是AS的发生发展[4]。中医上并无“动脉粥样硬化”的病名，根据中医辩证分析，目前认为其属于中医传统理论中的血瘀证，治法为活血化瘀。水蛭为破血逐瘀通经的经典虫类药。为保证实验药物质量疗效的统一，本实验选择单味水蛭中成药脉血康胶囊，其内容物仅有水蛭粉。本研究旨在观察水蛭对AS小鼠自噬的影响，为中药防治AS拓展新的研究思路。

一、材料与方法

1 材料

动物8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠8只及ApoE-/-小鼠40只，体质量18～22 g, 购自广东药康生物科技有限公司。动物生产许可证号：SCXK(粤)2020-0054。动物实验经广东药科大学附属第一医院实验动物伦理委员会批准(批号：00311859)。

药品与试剂脉血康胶囊，成分：水蛭粉，规格：每粒0.25 g, 批号：20211021,批准文号：国药准字Z10970056,重庆多普泰制药股份有限公司生产。总胆固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)检测试剂盒，均为广州伊莱瑞特生物科技有限公司生产；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均为广州瑟烨生物科技有限公司生产；改良油红O染色试剂盒，广州昂飞生物科技有限公司生产；LC3抗体，上海优宁维生物科技股份有限公司生产；Beclin-1抗体，广州辰星生物科技发展有限公司生产；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司生产。

仪器Multiskan-GO全波长酶标仪，美国Thermo Fisher公司产品；HT7800透射电子显微镜，日本HITACHI公司产品；ECLIPSE CI正置光学显微镜，日本NIKON公司产品；Biorad Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳仪、Biorad Trans-BlotTurbo转印系统，均为美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 小鼠分组及干预

动物于广东药科大学附属第一医院SPF级动物实验室饲养，温度(24±1)℃,相对湿度40%～60%,室内通风良好，光照10～12 h, 可自由捕食、饮水。8只雄性C57BL/6J小鼠为空白组，40只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、对照组、高剂量实验组、中剂量实验组、低剂量实验组，每组8只。除空白组给予普通饲料喂养外，其余各组均每日给予高脂饲料(配方：20%脂肪+1.25%胆固醇)喂养建立AS模型。高脂饲料喂养8周后，进行药物干预，期间继续给予高脂饲料喂养，根据人和小鼠体表面积换算得出小鼠的给药剂量，即高、中、低剂量实验组小鼠分别灌胃给予1.8、0.9、0.45 g·kg-1·d-1脉血康胶囊水溶液，对照组小鼠灌胃给予3×10-3 g·kg-1·d-1辛伐他汀水溶液，空白组、模型组以等量0.9%NaCl灌胃，每日1次，共药物干预12周。

2.2 比色法检测小鼠血清血脂水平[5]5]

麻醉小鼠处死，眼眶取血，室温静置30 min, 以3 000 r·min-1离心15 min后分离血清，-80 ℃冰箱保存备用。严格按照说明书进行操作，用全波长酶标仪546 nm波长检测各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.3 ELISA法测定小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-кB炎症因子水平[6]6]

将上一步所取得的血清作为待测样品，严格按照说明书操作。酶标仪450nm波长测量各孔光密度值，检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-кB含量。

2.4 油红O染色法观察小鼠主动脉病理变化[7]7]

打开胸腔，分离整条主动脉，并分离脂肪组织和结缔组织，将主动脉组织置于固定液固定24 h以上。固定后取出，用磷酸盐缓冲液浸洗2次，沿血管壁将血管纵向剖开。将剖开的血管浸入油红O染液中37 ℃染色60 min后取出，乙醇分化直至组织内脂肪斑块呈橘红色或鲜红色，其他部位无色，用蒸馏水洗2次。选择良好的光线条件，将染好的大体组织进行拍照。用Image J图像分析软件测量主动脉斑块面积和主动脉总面积。主动脉斑块面积百分比(%)=主动脉斑块面积/主动脉总面积×100%。

2.5 透射电镜法观察小鼠主动脉内自噬体的形成[8]8]

取主动脉弓处组织，将其分为1 mm3大小的组织块，用电镜固定液固定，4 ℃冰箱保存。用磷酸盐缓冲液漂洗3次，避光室温固定2 h。磷酸盐缓冲液漂洗3次，梯度乙醇脱水，不同浓度丙醇：树脂渗透，用包埋板包埋，包埋板置于60 ℃烤箱聚合48 h。取出树脂块于超薄切片机切片，铜网捞片。避光染色8 min; 70%乙醇清洗3次；超纯水清洗3次；避二氧化碳染色8 min; 超纯水清洗3次，滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

2.6 蛋白质印迹法检测小鼠主动脉自噬蛋白Beclin-1、LC3表达[9]9]

将剪碎的主动脉置于匀浆管中，加入裂解液，置于匀浆研磨仪匀浆，之后离心取上清液，测定蛋白浓度，按样比例制备电泳样品，样品上样前95 ℃沸水浴5 min, 制备凝胶，放入电泳装置中，加入电泳液，上样。电泳结束后，将凝胶与聚偏二氟乙烯膜放入转印系统，加入转膜液转印。转印结束后封闭液封闭，洗膜，加入一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗室温孵育，洗膜，滴加显影液，用凝胶成像系统显影。用Image J图像分析软件检测蛋白灰度值。

3 统计学处理

用SPSS 27.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示；进行正态性和方差齐性检验；若数据资料呈正态分布且方差齐，2组间比较用t检验，多组间比较用方差分析(ANOVA)并进行两两比较法；如果不呈正态分布或方差不齐，用秩和检验比较。用GraphPad Prism 8.0软件，绘制直观柱状图。

二、结果

1 水蛭对AS小鼠血脂水平的影响

空白组给予普通饲料喂养，其余各组均每日给予高脂饲料喂养建立AS模型。高、中、低剂量实验组小鼠分别灌胃给予1.8、0.9、0.45 g·kg-1·d-1脉血康胶囊水溶液，对照组小鼠灌胃给予3×10-3 g·kg-1·d-1辛伐他汀水溶液，空白组、模型组以等量0.9%NaCl灌胃。

与模型组比较，各给药组小鼠的TC、TG、LDL-C水平均降低，HDL-C水平则升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果表明，水蛭能有效改善AS小鼠血脂水平。结果见表1。

2 水蛭对AS小鼠炎症因子的影响

与空白组比较，模型组小鼠的IL-1β、NF-кB水平均明显增高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组相比，对照组和低、中、高剂量实验组的IL-1β、NF-кB水平均降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型组的IL-6、TNF-α与实验组、对照组和空白组相比，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果表明，水蛭能降低动脉粥样硬化小鼠炎症因子水平。结果见表2。

3 水蛭对AS小鼠主动脉斑块形成的影响

主动脉油红O染色发现，空白组小鼠主动脉内未见明显斑块；模型组小鼠主动脉壁上明显附着有斑块；与模型组相比，对照组和低、中、高剂量实验组主动脉内斑块分布减少。Image J分析显示，模型组、对照组和低、中、高剂量试验组小鼠主动脉占比分别为(34.63±2.56)%、(17.69±1.44)%、(26.86±1.47)%、(20.67±2.18)%和(24.17±1.29)%,与模型组相比，对照组和低、中、高剂量实验组小鼠主动脉占比减少，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果表明，水蛭能减少动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块形成。结果见图 1。

表1 水蛭对动脉粥样硬化小鼠血脂水平的影响

表2 水蛭对动脉粥样硬化小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-кB水平的影响

图1 水蛭对动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块的影响(油红O染色)

4 水蛭对AS小鼠主动脉斑块内细胞自噬情况的影响

自噬体以双层膜结构为主。空白组小鼠主动脉组织线粒体完整，且自噬体较少；模型组自噬体数量较空白组少，线粒体结构大多不完整；高剂量实验组和低剂量实验组自噬体数量较模型组多，中剂量实验组和对照组自噬体数量更多，线粒体结构较完整。

5 水蛭对AS小鼠主动脉自噬蛋白Beclin-1、LC3蛋白水平的影响

高、中、低剂量实验组和对照组、模型组的Beclin-1蛋白表达水平分别为1.48±0.05、1.72±0.05、1.19±0.02、1.51±0.04和0.66±0.03,LC3Ⅱ蛋白表达水平分别为1.53±0.01、1.83±0.02、1.16±0.01、1.90±0.01和0.49±0.01,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ分别为1.00±0.02、0.76±0.01、0.82±0.01、0.77±0.01和0.23±0.01,模型组的上述指标与各实验组和对照组相比，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见图2。

图2 水蛭对动脉粥样硬化小鼠主动脉Beclin-1和LC3蛋白表达的影响

三、讨论

AS是一种慢性炎症性疾病，是一个涉及多细胞的复杂病理过程。现代医学认为，AS的发生发展是由炎症过程驱动的。过量的未被代谢的脂蛋白聚集，氧化后与趋化因子接触，将白细胞吸引致炎症部位，血管表面的黏附分子促使单核细胞阻滞于此。当与血管内皮接触时，单核细胞会分化为巨噬细胞，摄取沉积的脂蛋白成为泡沫细胞，并产生局部炎症。泡沫细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α等细胞因子，募集更多免疫细胞，形成动脉粥样硬化。多项研究数据表明，IL-6等细胞因子在动脉粥样硬化斑块的起始、发展和急性破裂过程中起关键作用[10,11,12,13]。所以，降低炎症因子水平，可以有效降低AS事件的发生率。本研究结果显示，水蛭在降低血脂的同时，还可显著减低血清的炎症因子水平，从而减少斑块，降低心血管事件发生率。

有研究表明[14,15],自噬的增加会抑制炎症反应，抑制斑块的形成，减少斑块面积，减轻AS的发生，而自噬的抑制或损伤则会加剧炎症反应的发生。因此，自噬可以作为一种抗炎反应的保护机制，是治疗AS和相关心血管疾病新的潜在靶点。本研究中的透射电镜结果显示，水蛭能使AS小鼠的主动脉斑块自噬体形成增多，且能增加自噬蛋白Beclin-1、LC3蛋白的表达，证明自噬可能是水蛭抗动脉粥样硬化的重要机制。

水蛭可能通过降低血脂水平，调节主动脉斑块内细胞自噬水平，及降低炎症因子水平，减少动脉粥样硬化斑块的形成，达到抗动脉粥样硬化的作用，为水蛭的临床应用提供了科学依据。然而水蛭是如何调控自噬和炎症因子发挥作用，仍需进一步研究。

参考文献:

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[9]李思琦,赵兵,张磊,等.稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块自噬相关蛋白Atg5和LC3B的影响[J].中医药信息,2022,39(12):11-15.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82074139);广东省中医药管理局基金资助项目(20213013);

文章来源:韩倩倩,潘芸芸,温紫云等.水蛭对ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠自噬的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(05):688-692.