颞叶癫痫(Temporal lobe epilepsy, TLE)是癫痫的常见原因，也是难治性癫痫最常见的原因[1]。虽然许多类型的癫痫的确切原因仍然未知，但有研究显示炎症在癫痫发展中的作用[2]。大多数关于癫痫的研究都集中在影响神经元和神经胶质细胞之间通讯的神经炎症通路上。然而，外周免疫细胞也可能有助于癫痫的病理生理学[3]。有研究证明，白细胞释放的炎症介质在癫痫发作和致痫过程的发展中起着至关重要的作用[4];在这种情况下外周免疫细胞表型的表征可能有助于更好地理解TLE的病理生理学。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中最主要的兴奋性神经递质[5]。离子型谷氨酸受体(Ionotropic glutamate receptors, iGluRs)是谷氨酸门控的阳离子通道。基于序列同源性和受体药理学，iGluR亚单位分成4个受体家族，分别为α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, AMPA)受体亚单位、红藻氨酸受体亚单位、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)受体亚单位和孤儿受体亚单位。先前研究发现，神经元中功能性iGluR的类型取决于转录的基因，并可能因年龄、大脑区域、神经元类型、突触活性甚至疾病而异[6]。然而，尚不清楚TLE患者外周免疫细胞上iGluR的表达情况。鉴于外周免疫系统和中枢神经系统之间的双向交流，本研究比较了健康个体和TLE患者外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的iGluR受体表达水平变化，并鉴定出可能与TLE相关的iGluR亚单位。

1、资料与方法

1.1 一般资料

这项研究纳入2019年1月-2022年6月在本院接受治疗的17例TLE患者和21名健康对照者作为研究对象。癫痫发作和癫痫综合征的临床诊断参照国际抗癫痫联盟(International league against epilepsy, ILAE)标准[7]。本研究中TLE的诊断是基于癫痫症状学、发作期/发作间期脑电图检查表现和明确显示海马萎缩的神经影像学检查表现。纳入标准为符合TLE诊断，至少72 h(发作间期)没有癫痫发作，年龄18～65岁，有参与研究的意愿。健康对照组受试者的年龄18～65岁，没有癫痫或任何严重的神经精神障碍，并签署知情同意书作为入选标准。排除标准：纳入研究前1个月使用消炎药或抗生素、存在严重的神经精神障碍、接受过海马手术。健康对照组受试者的年龄和性别与TLE患者相匹配(P>0.05)。除了临床和社会人口统计学数据以及体重和身高的测量，还应用了汉密尔顿抑郁和焦虑量表(Hamilton anxiety scale/hamilton depression scale, HAM-D/HAM-A)和癫痫神经障碍抑郁量表(Neurological disorders depression inventory for epilepsy, NDDI-E)评估焦虑和抑郁症状。

1.2 总RNA提取和实时定量逆转录PCR

从所有研究患者及健康对照者中收集3 mL晨起静脉血样品，并参照文献方法[8]通过密度梯度离心法分离PBMCs。使用Gen Elute total RNA Miniprep(美国Sigma-aldrich公司)对所有样品进行总RNA提取处理，并使用Nanodrop(美国Thermo scientific公司)测量总RNA的水平。此外，在20 μL反应中使用Superscript Ⅲ逆转录酶(美国Invitrogen公司)将1 μg RNA转化为cDNA;还进行了逆转录酶阴性对照，以确认没有基因组DNA污染；使用SYBR Green Ⅰ(10000×)2×SYBR Green PCR Mastermix试剂盒(美国Invitrogen公司)和正向和反向引物各0.4 μM的10 μL体积中进行实时定量PCR;使用ABI Prism 7900HT/FAST型荧光定量PCR仪(瑞典Applied biosystems公司)进行扩增，初始变性在95 ℃下5 min, 随后是45个循环，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃30 s, 进一步通过解链曲线以确保单一产物扩增；使用仪器提供的SDS 2.4和RQ Manager 1.2软件分析循环阈值(Cycle threshold, Ct)值。在Data Assist v2.0软件上使用2 δCt方法计算每个靶基因相对于归一化因子(2个参考基因- IPO8和TBP的几何平均值)的表达水平。由于参考基因的表达水平在不同的细胞类型之间可能不同，因此本研究使用输入蛋白8(Importin 8,IPO8)和TATA盒结合蛋白(TATA-binding protein, TBP)进行标准化。基因特异性引物见表1。

1.3 蛋白质印迹法

使用放射免疫沉淀法(Radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解缓冲液(美国Bimake公司)提取PBMCs中的蛋白质；采用二辛可宁酸(2,2′-Biquinoline-4,4′-dicarboxylic acid, BCA)蛋白质检测试剂盒(美国Pierce biotechnology公司)用于蛋白质定量；然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离20 μg蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜(美国Millipore公司)上；将膜与一抗GluA3(1∶50,美国Santa cruz公司)和肌动蛋白(β-Actin)蛋白兔多克隆抗体(1∶2000,英国Abcam公司)在4 ℃孵育过夜；然后与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000;英国Abcam公司)在室温下孵育1 h; 使用增强型化学发光试剂(美国Pierce biotechnology公司)显示信号；使用Image-Pro Plus 6.0软件对条带的灰度值进行定量，并将目标蛋白的水平表示为相对于β-Actin标准化的相对灰度值。

表1 用于实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)的引物

1.4 细胞内钙离子水平的测定

将PBMCs粘附到聚-d-赖氨酸12 mm盖玻片上，并装载8 μM荧光Ca2+染料fura-2-乙酰氧基甲基酯(fura-2-AM,美国Sigma-aldrich公司);在37 ℃、5% CO2下孵育25 min, 然后在室温下去酯化后固定盖玻片并用含有(mM):NaCl 129.1,KCl 5.9、葡萄糖11.5、MgCl2 1.2,CaCl2 3.2的细胞外溶液灌注，并用NaOH调节至pH 7.3;在350和380 nm的激发波长下测量荧光，并通过Till vision成像系统(德国Till photonics公司);根据荧光比率计算钙水平：[Ca2+]=平衡解离常数(Dissociation constant, KD)×β×[比值(ratio, R)]-Rmin)/(Rmax-R);通过细胞外和细胞间Ca2+校正获得系数，KD=245,β=3.6,Rmin和Rmax分别是无Ca2+和饱和Ca2+时的比值(Rmax=0.8,Rmin=0.08);在调整到基线后胞质Ca2+水平变化被重新校准；参照文献报道的ATP(美国Sigma-aldrich公司)水平刺激细胞[9];一旦达到Fura-2的充分平衡，应用全细胞记录细胞外溶液10 s; 每个研究对象至少测量10个细胞。

1.5 统计学处理

使用SPSS23.0进行统计分析，并用GraphPad Prism 6绘制数据；采用Shapiro-Wilk正态性检验确定数据分布的正态性，正态分布的数据以均数±标准差表示，非正态分布的数据中位数(四分位数)[M(IQR)]表示，使用Student t检验或Mann-Whitney检验对2组正态或非正态分布的数据进行比较；分类数据采用例数(n)和构成比(%)表示，组间比较采用卡方检验。显著性水平设定为P<0.05。

2、结果

2.1 2组人口统计学和临床特征比较

表2显示了参与本研究的参与者的人口统计学和临床特征。2组在年龄、性别、教育水平和体重指数方面没有明显差异(P>0.05)。与健康对照组比较，TLE组在焦虑和抑郁量表上表现出更高的分数(P<0.05)。

2.2 PBMCs中特定iGlu受体亚单位的表达水平

本研究比较了2组个体中9个亚单位的表达水平。图1总结了非NMDA(AMPA和红藻氨酸)、NMDA和孤儿受体亚单位的表达水平；与健康对照组比较，TLE组PBMCs中AMPA受体亚单位GluA3 mRNA表达水平显著降低(P<0.001)。此外，通过蛋白质印迹分析证实了TLE组PBMCs中GluA3蛋白表达水平显著低于健康对照组(P<0.001)(图2)。

表2 研究参与者的人口统计学和临床特征

图1 PCR检测健康对照组和TLE组的PBMCs中特异性AMPA(A)、红藻氨酸(B)、NMDA(C)和孤儿(D) i Glu受体亚单位的mRNA表达水平  

图2 蛋白质印迹分析PBMCs中Glu A3的蛋白表达水平   

2.3 TLE患者单核细胞内Ca2+水平降低

使用来自TLE患者的210个细胞和来自健康对照组的234个细胞来测定ATP对细胞内Ca2+水平的影响。加入10 μM ATP后2组均产生了显著的Ca2+内流。细胞内Ca2+水平迅速达到峰值，然后衰减到持续升高的阶段。2组都未能将Ca2+水平恢复到最初的基线水平(图3)。曲线下面积以及峰值振幅揭示了2组在激动剂应用期间对刺激的反应性降低(图3)。与健康对照组比较，TLE组的PBMCs在第2个周期和第3个周期显示Ca2+水平显著降低(P<0.05)和在全部周期显示峰值振幅显著降低(P<0.05)。

3、讨论

在神经元中离子型谷氨酸受体集中在谷氨酸能突触的后位点，但也可在突触前和突触外发现。近年来，有研究发现这些受体也在免疫系统中表达，但对它们在TLE免疫功能中的作用知之甚少[10]。本研究分析了谷氨酸受体离子通道的AMPA,NMDA、红藻氨酸或δ受体亚单位在TLE患者PBMCs中表达情况，以鉴定哪些亚型可能存在差异表达，结果表明TLE组PBMCs中AMPA受体亚单位GluA3 mRNA表达水平较健康对照组显著降低。已知AMPA GluA3亚单位在脊髓、脑干、丘脑和皮质中表达，并发现位于负责呼吸控制、心脏控制和运动协调的中心[11]。最近研究发现，GluA3基因敲除小鼠实际上缺乏脑电图和NREM睡眠的特征，表现为低频带(delta1、delta2和theta)的脑电图功率下降。此外，9只GluA3基因敲除小鼠中有3只在清醒和睡眠期间表现出癫痫发作，表明GluA3基因的缺失可能会导致癫痫发作[11]。GluA3基因敲除也产生状态依赖的呼吸调节，在行为静止时选择性降低呼吸频率。这些发现表明GluA3亚单位具有不同的神经生理学影响，调节睡眠、呼吸和癫痫发作产生的振荡网络[12]。但是GluA3的表达不仅限于神经系统，并对免疫系统也很重要。本研究的结果为GluA3在免疫细胞中的重要性提供了额外的证据。

图3 ATP降低TLE患者单核细胞的Ca2+内流  

人体血液中的谷氨酸水平为260～300 μM,而大脑中的间质水平要低得多，在低微摩尔至亚微摩尔范围内[13]。谷氨酸受体离子通道在谷氨酸结合后的几毫秒内激活，但仅在相对较短的时间内保持打开，如果高水平(>100 μM)的谷氨酸在较长时间内结合，则通过脱敏的过程失活[14]。由于血液中的谷氨酸盐水平很高(>100 μM),当细胞在血液中循环时免疫细胞中的离子型谷氨酸盐受体可能会被脱敏。然而，一旦这些细胞进入间质谷氨酸水平较低的组织，离子型谷氨酸受体就可能被激活。大量研究表明，谷氨酸或谷氨酸受体拮抗剂可调节免疫细胞功能，如细胞粘附、激活、增殖、迁移和细胞因子释放，这些变化是如何发生的尚不知道，但在某些情况下可能涉及钙通道的功能调节[15,16]。在中枢神经系统中GluA3受体以较慢的脱敏动力学介导电流，因此有助于细胞的紧张性去极化[17]。基于这些发现，本研究证实了粘附的单核细胞对ATP的应用有反应，2组细胞内的Ca2+水平均明显增高。在最初的ATP刺激后Ca2+水平迅速达到峰值，然后衰减至持续升高的水平。本研究的数据表明TLE患者的PBMCs具有较低的Ca2+缓冲能力和Ca2+动员能力。先前的研究表明，低水平的ATP可通过GluA3起作用，表明PBMCs中的钙紊乱与谷氨酸受体信号有关[18]。ATP被认为是细胞的能量供应；然而细胞器损伤也会导致ATP释放，并作为一种危险信号；在这种情况下ATP水平在细胞质中较高，但在细胞外水平相对较低。因此，新合成的ATP被转运出质膜。几项研究表明细胞外ATP高水平激活单核细胞并增加细胞毒性[11,19]。本研究发现TLE患者单核细胞上GluA3表达水平下调，同时细胞内钙储备减少。然而，尚不清楚GluA3表达水平变化能在多大程度上影响单核细胞的钙稳态。

总之，本研究发现与健康对照组比较，TLE组PBMCs上GluA3受体表达水平降低。通过神经递质进行免疫调节的领域仍处于起步阶段。PBMCs是不同细胞类型的混合物例如T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，不同细胞类型中iGluR亚单位表达的确切模式可能不同，因此谷氨酸对不同细胞群体的作用也不同。本研究的发现为这一神经免疫途径的重要性提供了初步证据。

参考文献:

[1]刘若婷,张志强,郝竞汝,等.基于体素形态学和基于球谐函数表面形态学的内侧颞叶癫痫海马结构磁共振成像表现分析[J].中华医学杂志,2021,101(37):3024-3028.

[2]许超,王娟,刘锋,等.下调miR-203靶向MEF2C/NF-κB抑制颞叶癫痫大鼠海马胶质细胞的活化和炎症反应[J].中国临床神经外科杂志,2021,26(6):449-454.

[3]谢文佳,夏天娇,周卿云,等.小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J].中国组织工程研究,2021,25(7):1109-1115.

基金资助:黑龙江省卫生健康委员会科研项目(H202250198);

文章来源:邓巍巍,王伟君,李富媛.颞叶癫痫患者外周免疫细胞上的谷氨酸受体表达水平变化[J].卒中与神经疾病,2024,31(01):42-47+72.