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杏仁核点燃癫痫大鼠模型中BKCa通道β4亚基动态变化

2024-03-07 34 上传者：管理员

摘要：目的：观察杏仁核点燃癫痫大鼠BKCa通道β4亚基动态演变情况。方法：建立杏仁核点燃癫痫大鼠模型，随机分对照组、点燃24 h组、30 d组、60 d组。采用尼氏染色观察各组神经元损伤情况；采用实时定量PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学检测发作后24 h、30 d、60 d大鼠脑内BKCa通道β4亚基表达的动态改变情况。结果：相比对照组，杏仁核点燃癫痫模型大鼠皮质及海马CA1、CA3区神经元均有明显缺失，且随着点燃时间增加，神经元计数呈下降趋势，各组差异有统计学意义（P<0.05）。点燃后24 h，皮质及海马BKCa通道β4亚基表达下降，且随着点燃时间增加呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：杏仁核点燃可导致脑内神经元持续损伤，同时伴随相应部位BKCa通道β4亚基表达下降，推测β4亚基可能参与了杏仁核点燃癫痫模型发生发展的过程。

关键词：
β4亚基
大通道钙激活钾通道
杏仁核点燃癫痫
癫痫
钾离子电导
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癫痫是神经元异常兴奋导致的脑功能障碍，以自发性和反复发作为特征；神经元细胞膜的变化可导致兴奋性增加而引发癫痫等疾病。钾（K+）通道因其稳定细胞膜的能力在膜兴奋性调节中发挥重要作用。在各种膜钾通道中，大通道钙激活钾通道（large channel calcium activated potassium channel,BKCa）的钾离子电导最高[1,2]。与其他钾离子通道不同，BKCa可以被电压和细胞内钙离子浓度升高激活，进而使膜复极化和快速超极化，影响神经元位放电，被认为是控制中枢神经系统神经元兴奋性的内在决定因子之一[3,4]。因此，BKCa表达和功能的变化在癫痫发病发生发展起着关键作用。本研究以具备颞叶癫痫典型病理改变的杏仁核点燃模型为对象，探讨癫痫发作过程中BKCa通道β4亚基的动态变化。

1、材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 实验动物及分组

成年健康雄性清洁级SD大鼠26只，体质量200～300 g，标准实验条件下饲养，适应性喂养1周。其中6只大鼠为空白对照，20只大鼠用于癫痫模型制作，模型点燃成功后随机分为24 h、30 d、60 d组。所有的动物实验均经华中科技大学协和深圳医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂

主要包括MaxiK beta抗体（Affinity Biosciences,DF8571）、实时定量PCR(Quantitative Realtime-PCR,QPCR）试剂盒等；蛋白质印迹（Western Blot）、免疫组织化学、尼氏染色所需试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 点燃模型制作

大鼠麻醉后，固定于立体定位仪。杏仁外侧核（右侧）坐标定位为[5]：旁开右侧4.8 mm(X），前囟后2.2 mm(Y），颅骨表面下8.5 mm(Z），置入五芯电极。术后1周，每天固定时间开始电刺激（细电流、连续串刺激、串长100、波宽1 ms、波间隔19 ms、频率50 HZ、刺激强度500μA、1次/d），记录刺激后大鼠行为学变化。发作强度参照国际通用的Racine分级[6]:0级：无反应；1级：不动，闭眼睛，耳朵和胡须颤搐，吸气及面部痉挛；2级：点头及更严重的面部痉挛；3级：前肢单肢阵挛；3.5级：双前肢阵挛，未直立；4级：双前肢阵挛伴身体直立；5级：强直阵挛发作伴随直立并背部倒地。连续10 d及以上出现4级以上发作视为成功点燃。根据分组在点燃24 h、30 d、60 d留取标本，制作石蜡切片或-80℃冻存备用。

1.2.2 尼氏染色

石蜡切片经脱蜡、固定后将玻片置于尼氏染色液中8～10 min，根据染色深浅调整染色时间，用蒸馏水终止染色；70%、95%、100%酒精梯度脱水；二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察并进行白光全扫。CaseViewer软件进行神经元计数。

1.2.3 QPCR

QPCR法检测BKCa通道β4亚基表达：取-80℃冰箱中保存的新鲜冰冻大鼠脑组织，分别分离大鼠皮质及海马。提取RNA，逆转录成cDNA,QPCR检测。引物序列如下：

1.2.4 Western Blot

同1.2.3冰上剥离大鼠皮质及海马，提取组织总蛋白，测定蛋白浓度，蛋白变性。制备凝胶，进性蛋白质电泳、电转移，加一抗、二抗孵育，进行免疫印迹显色，曝光，晾干胶片，扫描，用BandScan分析GAPDH及MaxiK-β4光灰度值，计算MaxiK-β4/GAPDH比值。

1.2.5 免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡洗片，进行抗原修复；加入一抗、二抗，室温孵育；加显色液，根据染色深度控制染色时间（阳性为棕黄色或棕褐色）；自来水终止，流水冲洗；苏木素复染后脱水、透明，中性树胶封片；显微镜下观察。Image-Pro Plus 6.0软件分析光密度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 点燃癫痫模型制作及行为学检测

6只大鼠纳入对照组；20只大鼠纳入模型组，制作点燃模型。点燃过程中1只电极脱落，1只20 d仍未达到4级发作，18只成功点燃，首次达到Racine 4～5级发作的时间为（11.22±1.99)d。连续10次达到4～5级发视为模型成功。模型组大鼠随机分为点燃24 h、30 d、60 d组，每组6只。

2.2 点燃时间对大鼠神经元损伤的影响

尼氏染色结果显示：对照组染色最清晰，海马区神经元排列规则，胞膜、胞核边界清晰，胞体及轴突完整，可见大量尼氏小体。细胞胞质染色为浅蓝色，尼氏小体大而数量多，呈蓝紫色；随着癫痫模型时间的增加，海马区神经元排列稍紊乱。海马及皮质神经元数量减少，部分神经元形态不完整，胞体肿胀，胞质可见空泡，尼氏小体数量减少，染色欠清晰。400倍光镜下行神经元计数，结果显示，对照组、模型24 h组、模型30 d组和模型60 d组正常形态神经元计数分别为：海马CA1区（178.44±12.80）个、（138.89±6.15）个、（104.67±9.94）个和（78.44±5.50）个；海马CA3区（206.50±6.71）个、（174.83±5.42）个、（125.83±6.27）个和（89.83±8.86）个；皮质分别为（286.33±5.43）个、（198.33±9.54）个、（141.67±9.24）个和（98.67±4.32）个。模型组神经元计数显著低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），且随着模型点燃时间增加，神经元计数呈降低趋势。结果表明点燃癫痫动物模型神经损伤是持续的过程，可能跟反复痫性发作相关，见图1-3。

2.3 癫痫模型中BKCa通道β4亚基变化

2.3.1 皮质BKCa通道β4亚基动态变化

①QPCR方法分析点燃癫痫模型不同时间β4亚基的变化，可见模型组明显低于对照组，且随着点燃时间增加，呈降低趋势，见图4A。相对表达量计算结果显示，对照组、模型24 h组、模型30 d组和模型60 d组分别为（1.05±0.09）、（0.58±0.09）、（0.31±0.03）和（0.19±0.04），各组差异有统计学意义（P<0.05）。②Western blot分析β4亚基表达与QPCR结果一致，对照组及模型组均有表达，模型组明显低于对照组，且随着点燃时间增加，表达呈降低趋势，见图4B。相对光密度值分析示β4亚基/GAPDH在对照组、模型24 h组、模型30 d组和模型60 d组分别为（1.04±0.04）、（0.65±0.05）、（0.49±0.02）和（0.23±0.04），各组差异有统计学意义（P<0.05），见图4C。③免疫组化染色显示着色清晰度一般，但仍可见β4亚基在各组皮质均有表达，见图5A-D。高倍镜下可见β4亚基（棕褐色物质）主要表达部位为细胞质，对照组及模型24 h组可见大量棕褐色着色细胞，模型30 d组及模型60 d组棕褐色物质表达减少。光密度分析示其在对照组、模型24 h组、模型3d组和模型60 d组分别为（0.016±0.005）、（0.016±0.005）、（0.006±0.003）和（0.006±0.003），模型组低于对照组，且随着模型点燃时间增加，表达呈降低趋势，与QPCR及Westernblot结果趋势基本一致，统计学分析示模型30 d/60 d组与对照组/模型24 h组，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组和模型24 h组，模型30 d组和模型60 d组之间，差异无统计学意义，见图5E。

图1 海马CA1区尼氏染色（400×，光学显微镜）

图2 海马CA3区尼氏染色（400×，光学显微镜）

图3 皮质尼氏染色（400×，光学显微镜）

图4 皮质BKCa通道β4亚基QPCR及Western blot检测结果

图5 皮质BKCa通道β4亚基表达免疫组化染色结果（400×，光学显微镜）

2.3.2 海马BKCa通道β4亚基动态变化

①QPCR方法分析点燃癫痫模型不同时间β4亚基的变化，可见模型组明显低于对照组，且随着点燃时间增加，呈降低趋势，见图6A；相对表达量计算示对照组、模型24 h组、模型30 d组和模型60 d组分别为（1.08±0.17）、（0.62±0.05）、（0.49±0.03）和（0.26±0.05），各组差异有统计学意义（P<0.05）。②Westernblot方法分析β4亚基表达，可见对照组及模型组均有表达，模型组明显低于对照组，且随着点燃时间增加，表达呈降低趋势，见图6B；相对光密度值分析示β4亚基/GAPDH在对照组、模型24 h组、模型30 d组和模型60 d组分别为（0.94±0.02）、（0.61±0.06）、（0.47±0.05）和（0.26±0.04），各组差异有统计学意义（P<0.05），见图6C。③免疫组化染色可见β4亚基主要在海马齿状回区表达。对照组及模型组齿状回均可见棕褐色着色细胞，着色清晰度一般，见图7A-D。

3、讨论

本研究结果表明，杏仁核点燃癫痫模型成功率较高（18/20），与既往报道一致[7]。在杏仁核点燃癫痫模型中，相比对照组，大鼠皮质及海马CA1、CA3区神经元均有明显的缺失，且随着点燃时间增加神经元计数呈下降趋势，表明点燃癫痫模型对神经元损伤是持续的过程。BKCa通道与癫痫的关系密切，实验结果还显示，点燃癫痫模型可以导致BKCa通道β4亚基表达降低，随着点燃时间增加，呈下降趋势，提示BKCa通道β4亚基可能参与了杏仁核点燃癫痫模型发生发展的过程。

图6 海马BKCa通道β4亚基QPCR及Western blot检测结果

图7 海马BKCa通道β4亚基表达免疫组化染色结果（100×，光学显微镜）

与其他动物模型相比，电点燃癫痫模型有独特的优点：在点燃阶段，规律的低电流刺激，降低了脑组织的直接损伤；通过刺激电极及记录电极植入，可以同步记录到动物癫痫发作与相应脑区痫样放电；点燃成功后，有自发性发作，可以更好的模拟人类癫痫反复发作性的特点；多项研究也发现电点燃模型的神经元损失主要发生在海马CA1区、CA3区、DG区等与颞叶癫痫相关的区域。本实验中，在癫痫大鼠皮质及海马中均发现正常神经元计数减少，且随着点燃时间增加，神经元计数呈降低趋势。说明点燃癫痫动物模型可以导致神经元持续丢失。

BKCa通道基因最初是从果蝇中克隆出来，随后发现其广泛表达于神经元、平滑肌、心肌和外分泌细胞等[8]。BKCa通道是一种特殊类型的钾通道，具有最大的单通道电导[9]。生理条件下，除了有膜去极化和细胞内钙浓度2种独立的激活途径外，它还受细胞内镁离子及氢离子影响[2]。BKCa通道抑制和兴奋作用的机制非常复杂。功能研究表明，BKCa通道激活引起动作电位复极化和进一步超极化的形成，使神经元的兴奋性降低，发挥抑制性作用。但有证据表明，BKCa通道的激活还可以促进某些脑神经元（如海马CA1锥体细胞）的高频放电；考虑可能是细胞外K+水平的变化可以改变细胞膜电位，使其持续去极化，从而导致阵发性放电[10]。BKCa通道的具体作用可能取决于它们的分布定位和不同类型通道表达。

BKCa通道是一种由成孔α亚基单独作为四聚体或与1～3个辅助β亚基，或辅助γ-亚基组成的多聚体结构。α亚基广泛表达于中枢神经系统皮质和海马区；其在谷氨酸能神经末梢中的表达比在GABA能神经末梢中更丰富。α亚单位也存在于苔藓纤维中，这是齿状回颗粒细胞的轴突，支配CA3锥体神经元-海马区的主要兴奋性投射[11]。与α亚基不同，β亚基克隆出4种亚型：β1～β4，分布于脑内神经元的主要是β4亚基，它以钙依赖的方式对BK通道产生双向效应。当局部钙离子浓度较低时，β4亚基抑制BK通道的激活，而在高钙离子浓度时则促进激活[12]。β2和β3亚基在脑内也有表达，而β1亚基则主要表达于大脑动脉平滑肌细胞。电生理和药理学证据表明，α亚基与β亚基的相互作用决定了在中枢神经系统观察到的BK通道亚型及功能。中枢神经元BK通道有3种亚型：Ⅰ型包括快速激活和N型失活（α+β2），和单独只有α亚基的非失活BK通道；Ⅱ型是非失活BK(α+β4），是脑内主要表达的BK通道，参与兴奋性调控[13]。

研究表明，BK通道在癫痫发作后早期增加神经元兴奋性，在单次癫痫发作后，阻断BK通道可防止随后的癫痫发作[14]。Savina等[15]报道，在听源性点燃的Krushinskii-Molodkin大鼠的齿状回神经元中，发现BKCa通道的α亚基上调和β4亚基下调。利用b4基因敲除小鼠也显示海马颗粒细胞BK通道的功能增强，从而使动作电位变得尖锐，放电频率增加。β4亚基敲除鼠表现出类似来自颞叶皮质的独特的癫痫发作形式，并且与齿状回的损伤相一致，表明β4亚基可能通过海马区同步化门控参与颞叶癫痫的发生[16]。在匹罗卡品致痫模型中发现，2 d后海马β4亚基表达下调，与表达减少一致的是，BK通道的亚型发生了转换，从Ⅱ型BK通道（BKα+β4），到Ⅰ型通道（仅BKα）；这种切换伴随着BK通道功能的改变及癫痫敏感性的增加[17]。本实验利用杏仁核电刺激点燃模型，观察BK通道β4亚基在急性期和慢性期的变化，点燃后24 h即发现皮质及海马区β4亚基表达下降，与既往研究一致；除此以外，研究还发现β4亚基表达随着点燃时间的增加，呈下降趋势，与神经元损伤程度也相一致。

综上所述，杏仁核点燃癫痫模型中，随着发作增加，神经元缺失呈上升趋势，同时伴随BKCa通道β4亚基表达下降，且表达部位在与癫痫关系密切的皮质与海马部位，表明β4亚基可能在杏仁核癫痫模型点燃过程中发挥作用。

基金资助:南山区科技计划项目(BKca通道介导突触传递功能异常在癫痫相关认知障碍中的作用及机制研究,No.NS2023032);广东省医学科研基金项目(腺苷激酶调控的腺苷-蛋白激酶C-cAMP信号通路激活BKCa通道:癫痫耐药的启动机制?No.A2020312);

文章来源:李巷,王亚如,李润琪等.杏仁核点燃癫痫大鼠模型中BKCa通道β4亚基动态变化[J].神经损伤与功能重建,2024,19(02):69-72+85.