首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 耳鼻咽喉肿瘤论文 > MYH11激活ERK/MAPK信号通路诱导喉鳞状细胞癌细胞生长和转移

MYH11激活ERK/MAPK信号通路诱导喉鳞状细胞癌细胞生长和转移

2025-01-13 172 上传者：管理员

摘要：目的探究肌球蛋白重链11 (myosin heavy chain 11, MYH11)对喉鳞状细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及机制。方法 q RT-PCR检测MYH11 m RNA在喉鳞状细胞癌组织以及喉鳞状细胞癌细胞中的表达。喉鳞状细胞癌细胞TU686分为si-MYH11组和si-NC组。FD-LSC-1细胞分为MYH11组和Vector组。CCK8、流式细胞术、细胞划痕、 Transwell实验分别用于检测细胞增殖、凋亡、迁移以及侵袭能力,蛋白质印迹检测各组细胞ERK 1/2磷酸化水平及MAPK相对表达量。结果 MYH11高表达于喉鳞状细胞癌组织及细胞。si-MYH11组TU686细胞增殖、迁移和侵袭能力显著低于si-NC组(P_均<0.05),细胞凋亡显著高于si-NC组(P<0.01), ERK1/2磷酸化水平及MAPK表达显著低于si-NC组(P<0.01)。MYH11组TU686细胞增殖、迁移和侵袭能力显著高于Vector组(P_均<0.05),细胞凋亡显著低于Vector组(P<0.01),ERK1/2磷酸化水平及MAPK表达显著高于Vector组(P<0.01)。结论 MYH11激活ERK/MAPK信号通路而促进喉鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

关键词：
MYH11
喉鳞状细胞癌
头颈部恶性肿瘤
生长
转移
加入收藏

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是常见的头颈部恶性肿瘤,位于头颈部肿瘤的第三位[1-2]。LSCC多发病于40～60岁男性,其发生发展与吸烟和饮酒等密切相关,多数LSCC患者确诊即为晚期,且治疗过程中易发生肿瘤转移与复发,患者预后差[3-4]。因此,需探究调控LSCC恶性生物学行为的多种机制及分子,寻找用于LSCC诊断和治疗的新靶点。MYH11由MYH11基因编码,是一种平滑肌肌球蛋白,属于肌球蛋白重链家族,通过三磷酸腺苷水解诱导肌动蛋白丝滑动并引发肌肉收缩[5-6]。近年来逐渐有研究指出,MYH11在多种肿瘤中异常表达,Nie等[7]研究指出,MYH11在肺癌中高表达,可作为肺癌治疗药物设计的新靶点,并且可作为肺癌诊断的标志物。Wang等[8]亦研究发现,MYH11可调控胃癌的病理进程,并且与胃癌患者的预后密切相关。Zheng等[9]研究指出,MYH11与头颈鳞状细胞癌的不良预后密切相关。但是MYH11对LSCC发生发展或其恶性生物学行为的影响尚无报道,本研究即探究了MYH11在LSCC肿瘤及细胞中的表达以及对LSCC细胞生长和转移的影响,旨在为LSCC临床诊断和治疗新靶点的发现提供帮助。

1、材料与方法

1.1材料

经我院伦理委员会审批,选取2022年1月～2023年12月在我院手术切除的20例LSCC患者的癌组织及癌旁组织,所有样本经病理学诊断均确诊为LSCC。人喉鳞状细胞癌细胞TU686、TU177、AM-HN-8、FD-LSC-1以及人支气管上皮细胞系16HBE购自中国贝纳培养收集公司;LipofectamineTM3000转染试剂和TRIzolTM试剂购自美国Thermo Scientific公司;Trans Script®Uni Reverse Transcriptase和Trans Start®Tip Green q PCR Super Mix试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司;CCK8和细胞凋亡试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司;RI-PA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;p-ERK1/2、ERK1/2、MAPK以及GAPDH抗体购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.2细胞培养、分组与转染

TU686、TU177、AM-HN-8、FD-LSC-1、16HBE细胞均培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640培养基中。取对数生长期的TU686细胞分为si-MYH11组和si-NC组,根据LipofectamineTM3000转染试剂操作说明,siMYH11组细胞转染MYH11 si RNA,si-NC组细胞转染MYH11 si RNA阴性对照。取对数生长期的FD-LSC-1细胞分为MYH11组和Vector组,MYH11组细胞转染MYH11过表达pc DNA3.1质粒,Vector组细胞转染pc DNA3.1质粒空白质粒。转染48 h后,收集细胞进行后续研究。

1.3 q RT-PCR检测MYH11 m RNA相对表达量

使用TRIzolTM试剂提取喉鳞状细胞癌组织和癌旁组织、si-MYH11组和si-NC组TU686细胞、MYH11组和Vector组FD-LSC-1细胞总m RNA,根据Trans Script®Uni Reverse Transcriptase试剂盒合成c DNA,所得c DNA根据Trans Start®Tip Green q PCR Super Mix进行q PCR反应,反应程序为:94℃30 s;94℃50 s,60℃30 s,40次循环。记录各孔Ct值,使用2-△△Ct法计算MYH11相对表达量。引物序列如下,MYH11:上游引物为5′-ATGGCG-CAGAAGGGCCAACT-3′,下游引物为5′-CACAGGA AACTTCGCAGTGA-3′;GAPDH:上游引物为5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游引物为5′-GAAG-ATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.4 CCK8法检测细胞增殖

将各组TU686和FD-LSC-1细胞稀释至2×104个/m L,96孔板每孔接种100μL细胞稀释液,每组5个复孔,设置0、24、48、72 h 4个时间点,分别在对应的时间点取出对应的孔板,每孔加入10μL CCK8溶液,混匀后,37℃孵育4 h,使用酶标仪检测450 nm波长下各孔吸光度值(A值)。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡

分别取si-NC组和si-MYH11组TU686以及Vector组和MYH11组FD-LSC-1细胞1×106个于流式管中,每管加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI,并设置单染管,室温孵育15 min后,用预冷的Binding buffer重悬细胞,流式细胞仪检测各组细胞凋亡。

1.6细胞划痕检测细胞迁移

将各组TU686和FD-LSC-1细胞接种于24孔板中,细胞贴壁并生长至汇合度达80%时,使用20μL移液器枪头在孔板中央轻轻划痕,然后将培养基更换为不含FBS的RPMI-1640培养基,拍照记录划痕面积(S0 h),孵育72 h后拍照统计划痕面积(S72 h),划痕愈合率=(S72 h-S0 h)/S0 h×100%。

1.7 Transwell检测细胞侵袭

将Transwell小室中铺50μL Matrigel胶,用不含FBS的RPMI-1640将各组TU686和FD-LSC-1细胞稀释至1×105个/m L,Matrigel胶凝固后,小室每孔加入100μL细胞稀释液,然后至于含有600μL RPMI-1640 (含10%FBS)的24孔板中,培养箱中培养72 h,取出Transwell小室,Transwell小室底部固定后,结晶紫染色10 min,清洗晾干后,拍照,统计各孔细胞侵袭数。

1.8蛋白质印迹检测ERK/MAPK信号通路的激活

使用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白,每组取10μg总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白分离后,湿法转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,封闭后,PVDF膜与pERK1/2、ERK1/2、MAPK以及GAPDH抗体4℃孵育过夜,洗膜后与山羊抗兔Ig G室温孵育1 h,根据ECL化学发光试剂进行曝光,拍照。

1.9统计学分析

使用Graph Pad Prism7.0软件绘制图形及数据处理,所有数据以均值±标准差表示,两组间比较采用t检验法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 MYH11高表达于喉鳞状细胞癌组织及细胞

q RT-PCR检测显示,喉鳞状细胞癌组织中MYH11 m RNA表达显著高于其在癌旁组织中的表达(P<0.01)。人喉鳞状细胞癌细胞TU686、TU177、AM-HN-8、FD-LSC-1中MYH11 m RNA表达显著高于人支气管上皮细胞系16HBE (P<0.01),TU686细胞中MYH11 m RNA表达最高,D-LSC-1中MYH11 m RNA表达最低,提示MYH11可能具有调控喉鳞状细胞癌发生发展的功能(图1)。

图1喉鳞状细胞癌组织(A)及细胞(B)MYH11 m RNA相对表达量比较

与癌旁组织或16HBE细胞相比较,**P<0.01。

2.2 MYH11调控喉鳞状细胞癌细胞的增殖能力

CCK8检测细胞增殖结果显示,si-MYH11组TU686细胞增殖能力显著低于si-NC组(P<0.05)。MYH11组FD-LSC-1细胞增殖能力显著高于Vector组(P<0.05),说明MYH11具有调控喉鳞状细胞癌细胞增殖的功能(图2)。

图2各组TU686 (A)和FD-LSC-1 (B)细胞增殖能力比较

与si-NC组或Vector组细胞相比较,*P<0.05,**P<0.01。

2.3 MYH11调控喉鳞状细胞癌细胞凋亡

流式细胞术检测显示,si-MYH11组TU686细胞凋亡率显著高于si-NC组(P<0.01),MYH11组FD-LSC-1细胞凋亡率显著低于Vector组(P<0.01),说明MYH11可调控喉鳞状细胞癌细胞的凋亡(图3)。

图3各组TU686 (A)和FD-LSC-1 (B)细胞凋亡率比较

与si-NC组或Vector组细胞相比,**P<0.01。

2.4 MYH11调控喉鳞状细胞癌细胞的迁移能力

细胞划痕愈合率统计结果显示,si-MYH11组TU686细胞划痕愈合率显著低于si-NC组(P<0.01),MYH11组FD-LSC-1细胞划痕愈合率显著高于Vector组(P<0.01),说明MYH11可调控喉鳞状细胞癌细胞迁移能力(图4)。

图4各组TU686 (A)和FD-LSC-1 (B)细胞划痕愈合率比较(×10)

与si-NC组或Vector组细胞相比,**P<0.01。

2.5 MYH11调控喉鳞状细胞癌细胞的侵袭能力

Transwell实验结果显示,si-MYH11组TU686细胞侵袭数显著低于si-NC组(P<0.01),MYH11组FD-LSC-1细胞侵袭数显著高于Vector组(P<0.01),说明MYH11可调控喉鳞状细胞癌细胞侵袭能力(图5)。

图5各组TU686 (A)和FD-LSC-1 (B)细胞侵袭数比较(×20)

与si-NC组或Vector组细胞相比较,**P<0.01。

2.6 MYH11调控喉鳞状细胞癌细胞ERK/MAPK信号通路

蛋白质印迹检测结果显示,si-MYH11组TU686细胞中ERK磷酸化以及MAPK蛋白表达均显著低于si-NC组(P<0.01),MYH11组FD-LSC-1细胞中ERK磷酸化水平及MAPK蛋白表达显著高于Vector组(P<0.05),说明MYH11可激活ERK/MAPK信号通路(图6)。

图6各组TU686 (A)和FD-LSC-1 (B)细胞ERK/MAPK信号通路激活比较

与si-NC组或Vector组细胞相比较,*P<0.05,**P<0.01。

3、讨论

LSCC是常见的头颈部恶性肿瘤之一,其主要的治疗方式为手术治疗,虽然肿瘤切除手术的发展已具有显著的进展,但是LSCC患者的生存率及预后均未有显著提高,并且LSCC患者往往在确诊时已是晚期,错过了最佳手术治疗时机[10-11]。目前,LSCC发病机制尚不确定,但是有研究指出,LSCC的发生发展与吸烟、饮酒、环境、遗传等因素密切相关[12]。因此,探究更多调控LSCC生长、转移、复发等病理过程的新机制及关键调控分子对于LSCC治疗和诊断新靶点的发现以及预后评价指标的发现具有重要意义。

MYH11基因全长153 898 bp,位于人类染色体16p13.11位,由40个外显子和39个内含子组成[13]。MYH11基因可编码肌球蛋白重链11,在机体生长过程中,可调控细胞间信号转导,影响细胞器运动与肌肉的收缩功能[14]。研究指出,MYH11的突变以及异常表达会引起主动脉夹层及胸主动脉瘤的发生[15]。近年来逐渐有研究发现,MYH11与多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关,并且可通过多种途径调控肿瘤的生长和转移。Kurata等[16]研究指出,MYH11可与CBFB结合形成融合蛋白,抑制造血干细胞的成熟与分化,进而诱导急性髓系白血病的形成(acute myeloid leukemia,AML)。Biernacki等[17]亦研究发现,CBFB-MYH11复合物可作为肿瘤新抗原,诱导CD8+T细胞对AML的杀伤。Jia等[18]亦研究指出,MYH11是在胆囊癌中高表达,并且是调控胆囊癌发展的关键基因。但是MYH11在LSCC中的表达以及对LSCC细胞恶性生物学行为的影响尚无报道。本研究检测发现LSCC肿瘤组织中MYH11 m RNA表达显著高于其在癌旁组织中的表达,MYH11 m RNA在LSCC细胞中的表达显著高于其在人支气管上皮细胞中的表达,提示MYH11可能对LSCC细胞的恶性生物学行为具有调控功能。

为了探究MYH11调控LSCC细胞的恶性生物学行为,本研究在LSCC细胞TU686中转染si RNA抑制MYH11的表达,FD-LSC-1细胞中转染MYH11过表达质粒,转染后检测发现,抑制MYH11后,TU686细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著下降,细胞凋亡显著增加。而过表达MYH11后FD-LSC-1细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增加,细胞凋亡显著降低,说明MYH11可调控LSCC细胞的恶性生物学行为。

ERK/MAPK信号通路是调节细胞生长和发育的核心通路,ERK是一种传递有丝分裂原信号的信号转导蛋白,被激活后,ERK转移至细胞核,调节转录因子活性和基因表达。ERK/MAPK信号通路的异常激活可影响结肠癌和肝癌等癌症的发展[19],Wang等[20]研究表明,抑制ERK/MAPK信号通路可抑制LSCC的生长和转移。本研究发现抑制MYH11后,TU686细胞中ERK/MAPK信号通路被显著抑制,过表达MYH11后,FD-LSC-1细胞ERK/MAPK信号通路被显著激活,说明MYH11可激活ERK/MAPK信号通路。

综上所述,本研究发现MYH11在LSCC组织和细胞中显著高表达,并且可促进LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制肿瘤细胞的凋亡,其机制可能为MYH11激活ERK/MAPK信号通路,进而诱导肿瘤的恶性生物学行为。但是本研究仅在细胞水平证明了MYH11的功能,MYH11是否能成为LSCC诊断和治疗的新靶点还需要进一步探究。

基金资助:自贡市重点科技计划项目(No.2022ZCYKY07);高质量发展重点研发科技计划项目(No.2024GZL04)~~;

文章来源:钟华才,郑跃彬,杨羿容,等.MYH11激活ERK/MAPK信号通路诱导喉鳞状细胞癌细胞生长和转移[J].医学分子生物学杂志,2025,22(01):62-67.