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下咽癌病理切缘判断应用太赫兹时域系统的实验研究

2020-07-07 164 上传者：管理员

摘要：目的:探讨太赫兹系统鉴别下咽癌肿瘤组织与正常组织的准确性,及其在下咽癌病理切缘判断中的作用。方法:选用SPF级5周龄雄性BALB/c裸鼠,皮下注射法构建人下咽癌裸鼠移植瘤模型。将获得的移植瘤标本进行病理学诊断,以确定肿瘤组织范围。利用太赫兹时域光谱系统分别扫描人下咽癌裸鼠移植瘤肿瘤组织、正常组织和癌旁组织标本。通过对冷冻切片和石蜡切片的检测,获得差异性光谱数据,将所得数据进行t检验比较。结果:肿瘤组织的太赫兹吸收系数高于正常组织,冷冻切片中当检测频率大于0.48THz时其差异有统计学意义(P<0.05);石蜡切片中在0.2～1.6THz的有效频谱范围内,其差异有统计学意义(P<0.01)。经两种方式处理的标本,肿瘤组织和正常组织折射率差异均有统计学意义(P<0.01)。癌旁组织太赫兹吸收系数落在正常组织和肿瘤组织之间。结论:太赫兹技术能够准确判断肿瘤组织和正常组织,并且能够灵敏地检测出癌旁组织的光谱变化,将可能成为病理切缘诊断的另一种工具。

关键词：
下咽肿瘤
光谱变化
太赫兹时域光谱系统
病理切缘
癌旁组织
耳鼻咽喉肿瘤
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目前手术是治疗下咽癌的主要方式。喉镜、CT、MRI等影像学检查能够帮助医生评估肿瘤大小及边缘,进而制定科学的手术方案,但这些方法尚不能指导肿瘤组织的彻底切除。彻底切除肿瘤组织对患者的治愈至关重要[1],阴性手术切缘是保证肿瘤彻底切除的主要指标,是头颈部恶性肿瘤独立的、最重要的预后因素,对降低肿瘤局部复发和提高患者远期生存率具有决定性意义[2]。目前,冷冻切片几乎是头颈外科术中判断手术切缘的唯一方法[3],但有研究发现,该诊断方法仍存在一定的假阴性和不可诊断率[4,5,6]。因此,寻找一种能够在术中与冷冻切片相互补充,准确判断下咽癌手术切缘的方法具有重要意义。

随着技术和材料的发展,太赫兹技术的应用在医学、化学、国防安全和通信等多个领域掀起研究热潮[7],近年来越来越多地应用于肿瘤研究[8,9]。本研究中,我们用太赫兹时域光谱系统检测人下咽癌裸鼠移植瘤标本,通过分析其相关的光学指标,评估太赫兹检测技术在判断下咽癌手术切缘中的作用,旨在寻找一种能够在术中快速判断肿瘤切缘的新方法。

1、材料与方法

1.1实验设备和检测条件

1.1.1实验仪器设备

日本ADVANTEST公司生产的太赫兹光谱系统TAS7500SP(图1a),系统频谱范围0.1～4.0THz,频谱分辨率为7.6GHz,信噪比不低于70dB,系统内置干风机和循环冷却装置。该系统可获得吸收系数、折射率、相位差、吸光度等多种光学参数。

1.1.2检测条件的优化

标本检测过程中很多因素都会对检测结果产生影响,为降低无关因素影响,检测前我们对检测条件及标本制作等进行优化。最终确定石蜡切片厚度为1mm,冷冻切片厚度60μm,太赫兹检测孔直径3mm,冷冻切片以定制规格为75.0mm×25.0mm×0.5mm的石英片做载玻片和盖玻片。

1.2实验标本的获取及处理

1.2.1人下咽癌FaDu细胞裸鼠移植瘤模型构建

SPF级5周龄雄性BALB/c裸鼠15只(购于斯贝福北京生物技术有限公司),以背部皮下注射法植入人下咽癌FaDu细胞(购于美国ATCC公司)。当瘤体直径>1cm时,麻醉后断颈法处死裸鼠,分别剥取肿瘤组织和周围正常组织,将偏小瘤体与周围组织整体剥离。所得标本对半切割,一份立即置入油酸-20℃冻存,以备制作冷冻切片;一份经彻底脱水后,制作石蜡包块。

1.2.2切片标本制作

苏木精-伊红染色切片和石蜡切片:切割石蜡包块,制作苏木精-伊红染色切片用于病理学诊断。保持蜡块原有切面不变,使其与苏木精-伊红染色切片为同一平面,对另一侧进行水平切割,制作厚度为1mm的石蜡切片。冷冻切片:取出冻存在油酸中的标本,用擦镜纸吸去标本表面油酸,冷冻切片机切取60μm厚的冷冻切片,将其于石英玻片上展开(该过程需在5min之内完成)。冷冻切片检测后,所有冷冻标本均行组织病理学检测作对比分析。

1.3研究方法

1.3.1组织病理学检查

苏木精-伊红染色切片例行病理学诊断,确定肿瘤组织、正常组织及癌旁组织(移植瘤边缘区域)。

1.3.2太赫兹时域光谱系统扫描

实验采用透射式(图1b)太赫兹检验方式。打开干风机和冷却装置,待温度降至20℃左右、湿度低于30%后,将标本置于检测区中,调整测量参数,扫描石蜡切片和冷冻切片。每个标本取3～5个不同检测位点,每个位点重复4次检测,取平均值。

1.4统计学分析

采用Origin2018统计学软件分析标本光谱数据,计量资料用t检验比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1人下咽癌FaDu细胞移植瘤标本获取

获得11例移植瘤标本,其中6例较大瘤体,将肿瘤组织和正常组织分开剥取;5例较小瘤体,肿瘤和周围组织整体剥取。所得标本对半切割,分别制作冷冻切片和石蜡标本。

2.2组织病理学表现诊断

苏木精-伊红染色切片可见肿瘤组织细胞排列紧密、无序,无明显细胞界限;细胞核大,呈圆形或椭圆形,核内深染。整体剥离的移植瘤标本(图2)中同时含有肿瘤组织和正常组织,移植瘤呈膨胀型生长,无浸润,肿瘤组织和正常组织之间有光滑的边缘。

2.3肿瘤组织与正常组织光谱数据分析

无论在冷冻切片还是石蜡切片中,肿瘤组织太赫兹吸收系数均明显高于正常组织(图3a、3b)。冷冻切片中,检测频率处于低频阶段时,两种组织吸收系数较为接近,差异无统计学意义。随着检测频率的升高,两者对太赫兹波的吸收能力呈现上升趋势,正常组织吸收系数上升趋势平缓,而肿瘤组织吸收系数上升幅度较大。当系统检测频率大于0.48THz时,肿瘤组织与正常组织吸收系数差异有统计学意义(P<0.05)。石蜡切片中,随着检测频率的升高,两种组织吸收能力均不断上升。在有效频谱范围内肿瘤组织的光谱吸收系数始终高于正常组织,且差异有统计学意义(P<0.01)。此外,由两种切片组织吸收系数值可知,冷冻切片中组织的吸收系数明显高于石蜡切片。

太赫兹折射率曲线(图3c,3d)显示,冷冻切片中,肿瘤组织太赫兹折射率在0.8THz附近出现了较弱的峰谷波动,随后逐渐下降;正常组织折射率在0.5THz前下降较快,而后逐渐趋于平缓。石蜡切片中,组织的太赫兹折射率缓慢下降。与吸收系数相似,肿瘤组织太赫兹折射率始终高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4癌旁组织光谱数据分析

在对肿瘤组织和正常组织检测的基础上,进一步检测下咽癌裸鼠移植瘤癌旁组织。随着标本检测位点的移动,其太赫兹吸收系数在肿瘤组织和正常组织之间不断变化(图4)。癌旁组织太赫兹吸收曲线误差线与正常组织或肿瘤组织之间出现部分交叉现象,但未见明显规律性变化。

图1太赫兹检测设备

图2组织病理学表现

图3太赫兹吸收系数和折射率图谱

图4癌旁组织太赫兹吸收系数图谱

3、讨论

太赫兹波(Terahertzwaves)是一种频率在0.1～10.0THz(1THz=1×1012Hz)之间的电磁波,又称太赫兹辐射。在生物医学研究应用中有以下优点:①许多生物大分子的振动跃迁能级在太赫兹波段,其变化能够被太赫兹灵敏地捕捉[10];②太赫兹波能够穿过许多非极性物质和介电材料,对不透明物体成像[11];③太赫兹的光子能量低,不产生电离辐射,生物检测安全性高[12];④水分子等极性分子对太赫兹有较高的吸收特性,可用来区分癌与正常组织等含水量不同的生物组织。目前,太赫兹波谱和成像技术在乳腺癌[13]、皮肤癌[14]、脑胶质瘤[15]等方面的应用已得到巨大发展。

下咽癌手术切除过程中对肿瘤切缘的要求较高。本研究中,我们以下咽癌作为模式疾病,探究太赫兹时域光谱系统鉴别肿瘤组织与正常组织的功能,以及该系统在下咽癌边缘判断中的作用。利用太赫兹时域光谱系统透射式模块,检测人下咽癌移植瘤。组织的太赫兹吸收系数没有明显吸收峰,但癌组织吸收系数和折射率明显高于正常组织,这种光谱差异能够帮助我们准确鉴别肿瘤和正常组织。生物组织中,水分是细胞生命活动的良好溶剂和重要参与者,占细胞湿重的70%～80%。癌变组织生长速度快,细胞代谢旺盛,细胞含水量、血供等通常高于正常组织。太赫兹吸收系数图显示,无论正常组织还是肿瘤组织,其冷冻切片吸收系数比石蜡切片高出一个数量级。在高频阶段,冷冻切片中肿瘤组织吸收系数是正常组织的2～3倍,经彻底脱水的石蜡切片中则不足2倍。可见,组织水含量对太赫兹波的强烈吸收是造成这种光谱差异的主要因素[16,17]。此外,石蜡切片光谱数据显示,两种组织太赫兹吸收系数和折射率亦呈现显著差异。生物组织中水分以自由水(95.5%)和结合水(4.5%)两种状态存在,石蜡标本制作过程高温加热使结合水脱离组织,排除了绝大部分水分的干扰[18]。因此即使脱水过程中有少部分结合水残留,也可判定为除含水量之外的其他因素主导了石蜡切片中移植瘤与正常组织的光谱差异。一方面,组织病理学诊断中发现,移植瘤细胞排列紧密,无明显的细胞界限,肿瘤组织这种细胞异型性[19]特点与其太赫兹吸收系数升高、光谱透过率下降的特征表现相吻合;另一方面,移植瘤组织细胞核深染,表明其蛋白质等细胞增殖所必须的生物分子含量高。生物分子的太赫兹特性研究显示,太赫兹波不仅可以表征生物小分子的特征吸收峰[20],亦可灵敏捕捉蛋白质等生物大分子的水合状态、构象变化[21,22]等。基于此我们推断,脱水后组织间的光谱特性差异可能是由肿瘤组织自身物质组成和结构变化造成的,Zhang等[23,24]在研究中也得出这一相似结论。以往研究显示,在0.2～0.5THz和1.0～1.5THz之间时,胃癌组织具有特征性的太赫兹波谱,这有助于区别正常组织[25]。而Ashworth等[13]则进一步结合太赫兹成像技术,发现太赫兹波谱技术和成像技术均可以用来鉴别乳腺癌、脂肪和纤维组织。同样,Ji等[26]发现,利用反射式太赫兹成像系统,早期胃癌组织的反射强度即可高于正常黏膜组织,其结果与病理学图像有很好的一致性。这些结果均佐证,太赫兹技术对于肿瘤与正常组织有良好的鉴别能力。检测过程中,冷冻切片组织太赫兹吸收系数和折射率无明显峰值,但存在少数几个弱的震荡,这可能与生物组织的各向异质性相关。

以往关于太赫兹在肿瘤方面应用的研究中,大多集中在肿瘤组织和正常组织的鉴别上,鲜有对于肿瘤细胞浸润的“临界边缘组织”的研究。因此本研究纳入可能含有微小癌灶的癌旁组织,结合病理学诊断以获得更准确的数据和结果。结果显示,移植瘤边缘组织太赫兹吸收系数介于肿瘤组织和正常组织之间。检测过程中,随着检测位置的微小变化,吸收系数在两者之间变化,可能是由于检测孔径覆盖肿瘤组织面积的变化造成的。综上所述,我们认为太赫兹时域光谱系统不仅能较为准确地区分肿瘤组织和正常组织,并且能够灵敏地检测到癌旁组织的光谱变化。通过技术上的改进,将有可能为术中下咽癌手术切缘的诊断提供新的途径。下一步,我们将研究评估太赫兹技术在术中判断下咽癌手术切缘的可行性。

参考文献：

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基金:中国博士后科学基金(No:2017M623367)