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肺炎支原体耐药性与23S rRNA耐药基因位点突变研究

2025-01-08 106 上传者：管理员

摘要：目的探析肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)患儿肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)耐药性及23S rRNA耐药基因位点突变情况，以期为临床治疗提供依据。方法对比分析本院2022年1月～2023年12月收治的MPP患儿临床资料，采用PCR技术检测23S rRNA耐药基因位点突变情况，结合药敏试验结果，探讨耐药性与基因突变间的关联。结果共分离出78株MP菌株。这些菌株对乙酰螺旋霉素、红霉素、克拉霉素和罗红霉素的耐药性超过50%,耐药率分别为75.64%、73.08%、51.28%和76.92%;对左氧氟沙星、环丙沙星和莫西沙星的耐药率低于10%,分别为3.85%、3.85%和1.28%。对78株MP菌株进行测序分析显示，23S rRNA耐药基因位点突变率为76.92%(60/78)。其中，47株为A2063G位点发生突变(78.33%,47/60),9株为A2064G位点发生突变(15%,9/60),4株为A2063C位点发生突变(6.67%,4/60)。47株A2063G位点突变MP菌株对罗红霉素、乙酰螺旋霉素完全耐药，对红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素、左氧氟沙星、环丙沙星和莫西沙星的耐药率分别为95.74%、63.83%、44.68%、17.02%、6.38%、6.38%和2.13%。9株A2064G位点突变MP菌株对罗红霉素完全耐药，对乙酰螺旋霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素的耐药率分别为88.89%、88.89%、77.78%、33.33%和22.22%,未对左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星产生耐药性。4株A2063C位点突变MP菌株对罗红霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素完全耐药，对克拉霉素耐药率为75%,对阿奇霉素、交沙霉素耐药率为25%,未对左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星产生耐药性。不同突变位点MP菌株对常用抗菌药物耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。在基因突变组患者中，咳嗽、发热、气促、寒战、呼吸音减弱、肺外感染和重症肺炎的发生率分别为100%、88.33%、66.67%、31.67%、71.67%、40%和63.33%。而在基因未突变组中，这些症状的发生率分别为94.44%、77.78%、44.44%、22.22%、27.78%、5.56%和33.33%。两组患者在咳嗽、发热、气促、寒战方面的差异无统计学意义(P<0.05),但在呼吸音减弱、肺外感染、重症肺炎方面的差异有统计学意义(P>0.05)。在基因突变组中，14例合并混合感染，感染率为23.34%,其中4例合并细菌感染，包括铜绿假单胞菌2例，肺炎克雷伯菌1例，鲍曼不动杆菌1例；10例合并病毒感染，包括腺病毒5例，流感病毒4例，合胞病毒1例。基因未突变组中，6例合并混合感染，感染率为33.34%,其中3例合并细菌感染，包括铜绿假单胞菌1例，肺炎克雷伯菌1例，肺炎链球菌1例；3例合并病毒感染，包括腺病毒2例，呼吸道合胞病毒1例。两组混合感染率差异无统计学意义。结论本院MP菌株对大环内酯类抗生素的耐药率较高，而对氟喹诺酮类抗生素的耐药率较低。23S rRNA耐药基因位点突变与MP菌株的耐药性密切相关，其中A2063G位点突变与高耐药率显著相关。

关键词：
23S rRNA
呼吸道感染性
耐药基因位点突变
耐药性
肺炎支原体
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肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniaepneumonia, MPP)是儿童中较为普遍的一种呼吸道感染性疾病，其病原体为肺炎支原体，导致呼吸道及肺部出现急性炎症反应，在非细菌性肺炎中占据1/3的比例[1]。肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是一种属于柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属的微生物，这种微生物的细胞膜结构非常独特，由多糖、蛋白质以及脂质层等成分构成的三层膜组成[2]。这种三层膜结构使得MP在细胞膜的稳定性和功能上具有一定的特殊性，从而在一定程度上影响了其在宿主细胞内的生存和繁殖方式。由于MP缺乏细胞壁结构，对某些类型的抗菌药物，如磺胺类和β内酰胺类药物，具有天然的耐药性。这意味着这些药物对MP感染通常无效。因此，在治疗MP感染时，大环内酯类抗菌药物成为了首选的治疗药物。然而，近年来，越来越多的病例报告显示，MP对大环内酯类药物的耐药性也在增加[3]。这种情况使得临床治疗MP感染变得更加复杂和具有挑战性。因此，深入研究MP耐药机制，对于优化临床治疗方案具有重要意义。多项科学研究和实验结果已经明确指出，MP的耐药性形成机制与其23S rRNA结构域中特定的靶位点发生突变有关，这些靶位点包括2063位点、2064位点以及2067位点[4]。当这些位点发生突变时，MP能够与大环内酯类抗生素直接结合的能力受到影响，从而导致MP对这类抗菌药物表现出高度的耐药性[5]。这种耐药性的出现使得原本用于治疗由MP引起的感染的药物变得不再有效，给临床治疗带来了极大的挑战。因此，了解和研究这些耐药机制对于开发新的抗菌药物和制定有效的治疗策略具有重要意义。

1、对象与方法

1研究对象

选择2022年1月～2023年12月入住河南中医药大学第一附属医院儿科医院的MPP患儿78例为本次研究对象。纳入标准：符合第8版《实用儿科学》相关诊断标准。排除标准：①病历资料不齐全；②既往有重症肺炎病史；③合并免疫功能抑制或缺陷者；④目前正在接受免疫抑制剂治疗；⑤既往患支气管哮喘、反复呼吸道感染患儿。

2资料收集

通过院内电子病历系统，收集患儿临床资料，包括年龄、性别、临床表现及混合感染情况等，对比不同分组患儿的临床表现及混合感染情况。

3标本采集及药敏敏感试验

所有患儿在入院后的24 h之内，使用经过消毒处理的棉签采集患者咽后壁的分泌物样本。采集完毕的样本接受适当的处理后接种至特定的MP培养基上，随后置于温度恒定为37℃的培养箱中，进行24～48 h的培养。培养过程结束后，将对结果进行细致的观察。若发现MP生长，培养基中的指示剂颜色将由初始的红色转变为黄色，据此判定该样本为阳性。接下来，使用MP培养药敏试剂盒进行药物敏感性测试，该试剂盒包含九种不同的抗菌药物，包括乙酰螺旋霉素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素、左氧氟沙星、环丙沙星和莫西沙星。严格按照试剂盒说明书的指示进行操作，并对测试结果进行详尽的分析。若上下两个孔中的培养液均从红色转变为黄色，则可判断该菌株对所测试的药物具有耐药性。反之，若两个孔中的培养液均保持红色不变，则表明该菌株对药物敏感。此外，若低浓度孔中的培养液由红色变为黄色，而高浓度孔中的培养液保持红色，则可认为该菌株对所测试的药物表现出中介敏感性。

4 23S rRNA耐药基因检测

通过聚合酶链反应(PCR)技术，对耐药性突变位点23S rRNA基因的2063(A:G)和2064(A:G)突变位点进行检测。首先，对MP菌株进行增菌培养，随后将菌液移至离心管中，进行10 min离心处理。去除上清液后，加入标本处理液并充分震荡混匀，再通过沸水浴处理10 min,以制备DNA模板，之后保存以备后续使用。参照GenBank数据库中23S rRNA的核酸序列(NC_000912),利用生物信息学软件设计所需的PCR引物[6]。扩增体系包括Mp-1F和Mp-1R引物各15 pmol, TaqDNA聚合酶1U,总反应体积为20μL。反应条件设定为：95℃预变性5 min; 93℃变性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸1 min, 35个循环；72℃延伸5 min,并在4℃下保存。取2μL的模板进行第二轮扩增，使用Mp-2F和Mp-2R作为第二轮扩增的引物，其余条件保持不变。取5μL的扩增终产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测目标片段的存在。对于检测结果为阳性的样本，进行纯化和测序(由上海生工生物技术服务有限公司执行),并将测序结果与基因库中的参考序列进行对比分析[7]。

5统计分析

采用SPSS 26.0对本次研究数据进行分析处理，对比不同分组MP菌株的耐药率及不同分组患儿的临床表现及混合感染情况，组间对比采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

1 MP菌株耐药性分析

78例MPP患儿，共检出78株MP菌株。药敏试验结果显示，78株MP菌株对乙酰螺旋霉素、红霉素、克拉霉素、罗红霉素的耐药率高于50%,分别为75.64%(59/78)、73.08%(57/78)、51.28%(40/78)、76.92%(60/78),对左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星的耐药率低于10%,分别为3.85%(3/78)、3.85%(3/78)、1.28%(1/78);对阿奇霉素、交沙霉素耐药率分别为32.05%(25/78)、14.10%(11/78)。

2 MP菌株23S rRNA耐药基因位点突变情况

对78株MP菌株进行测序分析，结果显示，60株出现23S rRNA耐药基因位点突变，突变率为76.92%(60/78)。60株出现23S rRNA耐药基因位点突变MP菌株中，47株为A2063G位点发生突变(78.33%,47/60),9株为A2064G位点发生突变(15%,9/60),4株为A2063C位点发生突变(6.67%,4/60)。

3 MP菌株耐药率与23S rRNA耐药基因位点突变情况的相关性分析

47株A2063G位点发生突变MP菌株，对罗红霉素、乙酰螺旋霉素的耐药率为100%(47/47),对红霉素的耐药率为95.74%(45/47),对克拉霉素的耐药率为63.83%(30/47),对阿奇霉素的耐药率为44.68%(21/47),对交沙霉素的耐药率为17.02%(8/47),对左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率为6.38%(3/47),对莫西沙星的耐药率为2.13%(1/47)。9株A2064G位点发生突变MP菌株，对罗红霉素的耐药率为100%(9/9),对乙酰螺旋霉素、红霉素的耐药率为88.89%(8/9),对克拉霉素的耐药率为77.78%(7/9),对阿奇霉素的耐药率为33.33%(3/9),对交沙霉素的耐药率为22.22%(2/9),未产生对左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星的耐药株。4株A2063C位点发生突变MP菌株，对罗红霉素、乙酰螺旋霉素、红霉素的耐药率为100%(4/4),对克拉霉素的耐药率为75%(3/4),对阿奇霉素、交沙霉素的耐药率为25%(1/4),未产生对左氧氟沙星、环丙沙星、莫西沙星的耐药株。不同突变位点的MP菌株对临床常用抗菌药物的耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1不同23S rRNA耐药基因位点突变分组MP菌株耐药率对比

4 23S rRNA耐药基因位点突变与未突变患者病情情况对比

基因突变组患者中，咳嗽60例(100%,60/60),发热53例(88.33%,53/60),气促40例(66.67%,37/60),寒战19例(31.67%,19/60),呼吸音减弱43例(71.67%,43/60),肺外感染24例(40%,24/60),重症肺炎38例(63.33%,38/60)。基因未突变组患者中，咳嗽17例(94.44%,17/18),发热14例(77.78%,14/18),气促8例(44.44%,8/18),寒战4例(22.22%,4/18),呼吸音减弱5例(27.78%,5/18),肺外感染1例(5.56%,1/18),重症肺炎6例(33.33%,6/18)。两组患者，出现咳嗽、发热、气促、寒战患者占比差异无统计学意义(P<0.05),出现呼吸音减弱、肺外感染、重症肺炎患者占比差异有统计学意义(P>0.05)。见表2。

5 23S rRNA耐药基因位点突变与未突变患者混合感染情况对比

基因突变组中，14例出现混合感染，感染率23.34%(14/60),4例合并细菌感染(6.67%,4/60),包括铜绿假单胞菌2例，肺炎克雷伯菌1例，鲍曼不动杆菌1例，10例合并病毒感染(16.67%,10/60),包括腺病毒5例，流感病毒4例，合胞病毒1例。基因未突变组中，6例出现混合感染，感染率33.34%(6/18),3例合并细菌感染(16.67%,3/18),包括铜绿假单胞菌1例，肺炎克雷伯菌1例，肺炎链球菌1例，3例合并病毒感染(16.67%,3/18),包括腺病毒2例，呼吸道合胞病毒1例。两组患者发生混合感染率差异无统计学意义(χ2=0.726,P=0.394)。

表2 23S rRNA耐药基因位点突变与未突变患者病情情况对比

3、讨论

本次研究中，78株MP对乙酰螺旋霉素、红霉素、克拉霉素和罗红霉素的耐药性超过50%,对左氧氟沙星、环丙沙星和莫西沙星的耐药率低于10%。大环内酯类抗菌药物由于其较低的毒副作用，已经成为临床治疗儿童MPP的首选药物。然而，近年来的研究表明，MP菌株对大环内酯类抗菌药物的耐药性呈现出逐年上升的趋势。在多个地区的调查中发现，耐药率已经高达69%～97%[8]。这一现象引起了医学界的广泛关注，因为耐药性的增加可能会导致现有的治疗方案失效，从而给临床治疗带来更大的挑战。因此，寻找新的治疗策略和开发新的抗菌药物成为了当务之急，以应对这一日益严重的公共卫生问题。

大环内酯类抗菌药物的主要作用机制是针对细菌的核糖体50S大亚基，通过物理性的阻塞通道来抑制新生肽链的延伸过程。这种阻塞作用有效地阻碍了蛋白质的合成，进而发挥其抑菌效果[9]。造成MP对大环内酯类抗菌药物耐药的主要耐药机制为MP的23S rRNA耐药基因位点发生突变，尤其是A2063G、A2064G导致对14元环和15元环大环内酯类抗菌药物发生耐药[10]。本次研究中，测序分析78株MP菌株发现，23S rRNA耐药基因位点突变率为76.92%。主要突变包括A2063G(78.33%)、A2064G(15%)和A2063C(6.67%)。23S rRNA耐药基因位点突变主要为A2063G,与谢俊杰等[11]研究结果相近。A2063G突变菌株对多种抗生素高度耐药，A2064G突变菌株对罗红霉素完全耐药，而A2063C突变菌株对罗红霉素、乙酰螺旋霉素和红霉素完全耐药。不同突变位点MP菌株对常用抗菌药物耐药率无显著差异。

根据相关研究结果表明，当感染23S rRNA耐药基因位点出现突变的MP菌株时，可能会引发一系列严重的并发症，包括支气管闭塞和肺不张等[12-13]。这些并发症的存在，使得MP感染引起的重症肺炎的风险大大增加[14-15]。本次研究中，基因突变组患者咳嗽、发热、气促、寒战、呼吸音减弱、肺外感染和重症肺炎的发生率分别为100%、88.33%、66.67%、31.67%、71.67%、40%和63.33%。基因未突变组中，这些症状的发生率分别为94.44%、77.78%、44.44%、22.22%、27.78%、5.56%和33.33%。两组在咳嗽、发热、气促、寒战方面无显著差异，但在呼吸音减弱、肺外感染、重症肺炎方面差异显著。基因突变组中，23.34%患者合并混合感染，包括细菌和病毒感染；基因未突变组中，33.34%患者合并混合感染，同样包括细菌和病毒感染。两组混合感染率无显著差异。

综上所述，MP菌株对大环内酯类抗菌药物的耐药率普遍较高，而对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率相对较低。23S rRNA耐药基因位点突变与MP菌株的耐药性密切相关，特别是2063(A:G)和2064(A:G)突变位点的存在与大环内酯类抗菌药物耐药性显著相关。对于儿童MPP的治疗，应充分考虑病原体的耐药特性，为患儿提供更为精准、有效的治疗方案。同时，加强对抗生素使用的监管，避免无序滥用，减缓耐药性的进一步发展。此外，还应开展多中心、大样本的研究，以全面揭示MP耐药机制，为临床提供更多循证医学依据。

参考文献:

[8]张慧芬,白海涛,李基明,等.肺炎支原体肺炎患儿肺炎支原体耐药性与DNA载量和基因型的关系研究[J].中国当代儿科杂志,2017,19(11):1180-1184.

[11]谢俊杰.广东三水地区肺炎儿童肺炎支原体流行病学､基因分型及耐药基因突变单中心研究[D].南方医科大学,2023.

[12]朱美君,季菊花,朱洁,等.儿童耐药肺炎支原体DNA载量与23s RNA基因2063位点突变的相关性分析[J].中国儿童保健杂志,2021,29(9):1017-1020.

[13]陈佳怡,张晗,尚云晓.肺炎支原体肺炎支气管肺泡灌洗液中23S rRNA耐药基因阳性患儿的临床及支气管镜下特点[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(12):897-902.

[14]施李芬,陈俐丽,余坚,等.24例23S rRNA A2063G基因突变肺炎支原体肺炎临床分析[J].中国小儿急救医学,2017,24(3):205-209.

[15]潘芬,孟磊俊,秦惠宏,等.儿童肺炎支原体23S rRNA基因位点突变检测分析[J].国际检验医学杂志,2017,38(6):760-762.

基金资助:2024年度河南省中医药科学研究专项课题(No.2024ZY2007);

文章来源:孙晓旭,董玉琼,赵永旺,等.肺炎支原体耐药性与23S rRNA耐药基因位点突变研究[J].中国病原生物学杂志,2025,20(01):52-56.