首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 儿科论文 > 儿科用药论文 > 儿童专用医院制剂紫黄软膏微生物限度检查方法

儿童专用医院制剂紫黄软膏微生物限度检查方法

2020-09-14 1208 上传者：管理员

摘要：目的:建立儿童专用医院制剂紫黄软膏微生物限度检查方法。方法:按照《中国药典》2015年版要求，采用供试品溶液稀释法(1∶100)进行需氧菌总数的测定;采用常规倾注平皿法进行霉菌和酵母菌总数的测定;采用供试品溶液稀释法(100mL)进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的控制检查。结果:需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数实验菌株回收比值均落在0.5～2.0的范围内;金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的控制检查实验组菌株生长良好，阴性对照组和样品组均无菌株生长。结论:本实验所建立的方法经过方法学验证，符合《中国药典》2015年版规定，可为医院制剂紫黄软膏质量标准的修订提供科学依据。

关键词：
儿科
医院制剂
微生物限度检查
稀释法
紫黄软膏
加入收藏

紫黄软膏是我院临床医师经多年临床实践研究开发出来的儿童专用纯中药医院制剂，具有治疗效果好、不良反应少等优点。医院制剂的特点是保证临床用药需求，弥补市场供应不足，一些效期较短、稳定性较差、临床需求量较小的品种，不适合制药企业大批量生产，具有不可取代的优势。但同时也存在着质量标准不完善的缺点[1]，如《中国医院制剂规范》和《医院制剂检验手册》中的品种，只有简单的定性、定量标准，微生物限度检查方面均是空白，一些自拟标准品种虽然有微生物限度检查项目，但方法却十分简单，与《中国药典》2015年版的要求相差甚远。为保证所采用的微生物限度检查方法的有效性和可行性，本研究按照《中国药典》2015年版的要求，以我院医院制剂紫黄软膏为研究对象，分别进行需氧菌总菌株计数、霉菌及酵母菌总菌株计数及控制菌检查方法研究，以期获得符合现行版《中国药典》标准的微生物限度检查方法[2]，确保检测结果的准确性和可靠性，进而保证临床用药的安全性和有效性。

1、实验材料

1.1供试品

紫黄软膏(昆明市儿童医院自制制剂)，批号20180725、20180802、20180925。

1.2菌种

金黄色葡萄球菌[CCMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CCMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CCMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]，均由中国药品生物制品检定所提供，传代在五代以内。

1.3培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基(批号1068601)、胰酪大豆胨液体培养基(批号1068901)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号1068011)、溴十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号1073801)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号1065732)，以上培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司，经过培养基方法学实验检查符合《中国药典》要求。

1.4仪器与设备

电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号JY10002)、鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司，型号GZX-GF101-3BS-II/H)、立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂，型号LDZM-60KCS-II)、生物安全柜(苏净安泰，型号BSC-1304IIA2)、垂直层流台(苏净安泰，型号SW-CJ-2FD)、生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号LRH-150F)、生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号LRH-150F)、霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号MJ-150F-I)，上述仪器经过校准合格，设备经过验证合格，状态良好。

2、方法

2.1供试液制备

取上述三个批次的供试品各10g，混匀后取10g于灭菌磨口锥形瓶中，加20mL灭菌的吐温80，搅拌，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，混匀，作为供试液(1)(1∶10)。取供试液(1)5mL，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液45mL，作为供试液(2)(1∶100)。

2.2菌液的制备

2.2.1金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液的制备

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的斜面培养物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取上述培养物各1mL于pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，分取各菌悬液1mL注入平皿中，立即倾注无菌胰酪大豆胨琼脂培养基约20mL，各菌悬液平行制备2个平皿，平皿法培养计数，取略小于10000CFU/mL的菌液备用。

2.2.2白色念珠菌菌液的制备

取白色念珠菌的斜面培养物一铂金饵，于无菌沙氏葡萄糖琼脂培养基中置20～25℃培养箱中培养2～3d，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂培养物1mL，加入9mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，取略小于10000CFU/mL的菌液备用。

2.2.3黑曲霉菌液的制备

取黑曲霉的新鲜培养物接种到无菌沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培养5～7d，加入3～5mL含0.05%聚山梨酯80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，将孢子洗脱。取1mL加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9mL中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，取略小于10000CFU/mL菌液备用。

2.3回收率测定

需氧菌计数:实验组取无菌试管5个，各加入供试液(2)10mL，分别加入0.1mL“2.2”项下的5种菌悬液，混匀后取其中1mL分别注皿，倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20mL，置30～35℃培养箱中培养不超过3d，计数，每种实验菌平行制备2个平皿，取平均值。

霉菌及酵母菌计数:实验组取无菌试管2个，各加入供试液(1)10mL，分别加入0.1mL“2.2”项下的白色念珠菌液、黑曲霉菌液，混匀后取其中1mL分别注皿，倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基约20mL，置20～25℃培养箱中培养不超过5d，计数，每种实验菌平行制备2个平皿，取平均值。

供试品对照组:取4个无菌平皿，将其分成2组，分别注入1mL供试液(1)和(2);分别加入0.1mLpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀后一组倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20mL，另一组倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基约20mL，置与实验组相同条件下培养，计数，取平均值。

菌液对照组:取5份稀释液各10mL于无菌试管中，分别加入0.1mL“2.2”项下的5种菌液，混匀后分别取1mL注皿。倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20mL(铜绿假单胞菌液、金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、白色念珠菌液、黑曲霉菌液注入该培养基)和沙氏葡萄糖琼脂培养基约20mL(白色念珠菌液、黑曲霉菌液注入该培养基)，置与实验组相同条件下培养，计数。每种实验菌平行制备2个平皿，取平均值。

2.4控制菌检查方法验证

2.4.1金黄色葡萄球菌检测方法验证

供试品组取“2.1”项下供试液(1)10mL，接种至不超过45℃的胰酪大豆胨液体培养基100mL中，置30～35℃培养18～24h。

实验组取“2.1”项下供试液(1)10mL，加入“2.2.1”项下金黄色葡萄球菌菌液0.01mL，混匀后加入100mL胰酪大豆胨液体培养基，置30～35℃培养18～24h。

菌液对照组取稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，加入“2.2.1”项下金黄色葡萄球菌菌液0.01mL，混匀后加入100mL胰酪大豆胨液体培养基，置30～35℃培养18～24h。

阴性对照组取稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18～24h。

取以上各组胰酪大豆胨液体培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上30～35℃培养18～72h，进行观察。

2.4.2铜绿假单胞菌检测方法验证

供试品组取“2.1”项下供试液(1)10mL，接种至不超过45℃的胰酪大豆胨液体培养基100mL中，置30～35℃培养18～24h。

实验组取“2.1”项下供试液(1)10mL，加入“2.2.1”项下铜绿假单胞菌菌液0.01mL，混匀后加入100mL胰酪大豆胨液体培养基，置30～35℃培养18～24h。

菌液对照组取稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，加入“2.2.1”项下铜绿假单胞菌菌液0.01mL，混匀后加入100mL胰酪大豆胨液体培养基，置30～35℃培养18～24h。

阴性对照组取稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10mL，加入100mL胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18～24h。

取以上各组胰酪大豆胨液体培养物分别划线接种于溴十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上30～35℃培养18～72h，进行观察。

3、结果

3.1回收率测定结果

回收率计算根据实验数据计算加菌回收率，结果需氧菌总菌株计数及霉菌和酵母菌总菌株计数回收率均在50%～200%的范围内，符合《中国药典》2015年版规定。见表1、表2。回收率(%)=[(实验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数]×100%[3]。

表1需氧菌培养总菌株计数回收率结果

表2霉菌和酵母菌培养总菌株计数回收率结果

3.2控制菌检查方法验证结果

金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查方法验证，实验组和菌液组对应菌株生长良好，阴性对照组和供试品组无菌生长，见表3。

表3控制菌检查方法验证结果

4、讨论

制剂微生物限度检查法的制定首先需要考虑方法的可操作性，苏润萍[4]对验证方法的选择进行优先排序:常规法>稀释法>中和法>薄膜过滤法>几种方法联合使用。能彻底消除制剂抑菌作用、计数结果较准确的是薄膜过滤法，但此法却不适用于非完全溶解的供试品。对于大多数中成药软膏制剂而言，处方中不溶性成分较多，而《中国药典》2015年版规定不能使用离心沉淀来减少药渣，采用此法易出现堵膜现象，难以确保方法的可操作性[5]。

本实验对需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的验证方法从最具优势的方法逐步进行预实验。测需氧菌总数时采用1∶10的供试液加菌回收比值<0.5，说明紫黄软膏对需氧菌总数具有一定的抑菌作用，采用1∶100和1∶1000稀释液加菌回收比值均落在0.5～2.0的范围内，为节省资源，所以选择1∶100的稀释液进行紫黄软膏需氧菌总数测定;测霉菌及酵母菌总数时采用1∶10的供试液加菌回收比值落在0.5～2.0的范围内，所以选择1∶10的供试液进行紫黄软膏霉菌及酵母菌总数测定。

紫黄软膏为不含药材原粉的中药制剂，按照《中国药典》2015年版规定控制菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。经控制菌的检测方法验证，实验组和菌液组对应菌株生长良好，阴性对照组和供试品组无菌生长。本研究所采用的检测方法有效、可行，且操作简单，可用于紫黄软膏微生物限度检查。

参考文献：

[1]李佐法,王波,冉晓静.医院制剂监督抽验中存在的问题及建议[J].药学研究,2014(8):490-491.

[2]唐苗,王菲.3种中药制剂微生物限度检查法验证[J].临床合理用药,2016,9(8):21-22.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].四部.北京:化学工业出版社,2015:142.

[4]苏润萍.《中国药典》2015版中药制剂微生物限度检查方法的比较及问题分析[J].医药卫生,2016(5):281.

[5]庞云娟,樊文研,刘康连,等.珍黄胶囊微生物限度检查方法适用性试验的研究[J].中成药,2018,40(3):711-715.

李惠英,秦利芬,李聃,杨晓峰.医院制剂紫黄软膏微生物限度检查法的建立[J].儿科药学杂志,2020,26(09):53-55.