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生命早期肠道菌群与婴儿神经发育的关系初探

2024-03-25 51 上传者：管理员

摘要：目的比较神经发育良好婴儿和神经发育迟缓婴儿的肠道菌群组成差异，分析生命早期肠道菌群与婴儿神经发育水平的关系。方法于2020年11月—2021年4月，在四川大学华西第二医院纳入28对母婴，在婴儿出生后第0天、第90天收集粪便并完成随访问卷，在婴儿12月龄时完成《年龄与发育进程问卷第三版》(ages and stages questionnaires-third edition, ASQ-3)。使用16S rRNA测序，检测婴儿肠道菌群结构和多样性，并分析生命早期肠道菌群与ASQ-3问卷得分的关系。结果根据12月龄婴儿ASQ-3评分结果将母亲及婴儿分为神经发育良好组(n=18)和神经发育迟缓组(n=10)。出生0天时，神经发育良好组厚壁菌门的相对丰度高于神经发育迟缓组(P<0.05),而变形菌门的丰度低于神经发育迟缓组(P<0.05);在出生第90天时，神经发育良好组中放线菌门、双歧杆菌科和肠球菌科的相对丰度均高于神经发育迟缓组(P<0.05)。Alpha多样性在两组间差异无统计学意义。Spearman’s相关性分析显示，出生后第0天婴儿粪便中的梭菌科相对丰度与12月龄婴儿的沟通能区得分呈正相关，而和粗大运动能区得分呈负相关；出生后第90天婴儿粪便中变形菌门和肠杆菌科的相对丰度与12月龄婴儿的沟通能力得分呈负相关，而丹毒梭菌科的相对丰度与粗大运动能区得分呈负相关。结论神经发育良好与迟缓婴儿的生命早期肠道菌群结构具有差异，并与12月龄时期婴儿沟通能区和粗大运动能区的发育有关联。提示生命早期肠道菌群与婴儿的神经发育水平有关。

关键词：
年龄与发育进程问卷第三版
生命早期
神经发育
肠内环境
肠道微生态
肠道菌群
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在生命早期，微生物开始定植于肠道并与肠内环境共同构成肠道微生态，其组成与结构广泛受到遗传、孕期环境以及婴儿自身等多方面的影响，致使肠道菌群呈现较大的个体差异[1]。本研究前期研究发现，生命早期肠道菌群的构成与后期过敏性疾病、肥胖和炎症性肠病的发生存在一定的关联，表明生命早期肠道菌群对婴儿远期健康有重要影响[2,3,4]。而在生命早期肠道菌群构建这一重要阶段，微生物群失调可引起代谢产物水平的变化，从而影响肠神经-中枢神经通路、脑免疫功能、血脑屏障完整性，还可增加中枢神经系统炎症的风险[5]。研究发现，相比正常儿童，患有自闭症、注意力缺陷、抑郁等心理精神疾病的儿童其肠道菌群多样性改变并伴有群落结构异常，而益生菌干预后能够改善部分神经异常行为[6]。目前，越来越多的研究着眼于不同神经发育水平儿童肠道菌群的差异性探究，但因研究的异质性、测序方法不同等，仍未有统一的结论。事实上，微生物、胃肠道和大脑之间相互影响，而这种影响与婴儿后期神经发育水平的关系仍处于探索阶段，尤其是婴儿胎便中的微生物群与后期神经发育水平的关联性尚未明确。

因此，本研究拟通过分析婴儿出生后第0天和第90天肠道菌群的多样性和组成，并阐明其与12月龄时《年龄与发育进程问卷第三版》(ages and stages questionnaires-third edition, ASQ-3)调查结果之间的关系，初步探究生命早期肠道菌群的构建与婴儿神经心理发育结局之间的相关性，为早期预防或改善不良的神经发育结局提供基于肠道菌群的新思路。

1、对象与方法

1.1调查对象

于2020年11月至2021年4月，在成都市某医院招募新生儿，从出生随访至满12月龄。本研究获新生儿家属知情同意及四川大学医学伦理委员会批准(No.K2020039)。

纳入标准：①新生儿出生于2020年11月至2021年4月，出生时龄在24小时内；②出生体重正常，健康；③单胎、自然受孕；④研究对象配合，居住在成都市内，自愿继续参加本研究，并签订知情同意书。

排除标准：①母亲产前1个月内服用过抗生素、益生菌或益生元产品；②新生儿转入新生儿科室；③在随访过程中出现严重疾病的婴儿；④婴儿粪便样品不全；⑤问卷填写不全。

本研究共招募母亲及婴儿88对，排除问卷填写不全及样品收集缺失的共60对，最后纳入分析的有28对。

1.2问卷调查

1.2.1出生后第0天在院问卷

由调查员现场调查，内容包括产妇的一般人口学资料、生活习惯、疾病史、抗生素类药物使用情况、分娩方式和孕周，以及新生儿的基本资料和抗生素类药物使用情况。

1.2.2出生后第90天随访问卷

由母亲填写线上问卷，内容包括婴儿3月龄时的儿童保健结果、配方奶粉食用情况、益生菌或益生元制品食用情况和1～3月疾病史。

1.2.3 12月龄时《年龄与发育进程问卷第三版》(ages and stages questionnaires-third edition, ASQ-3)

由婴儿实际抚养人线上填写，通常为婴儿母亲。ASQ-3问卷购自上海杖元信息科研有限公司。ASQ-3问卷可筛查1～66月龄儿童的神经心理发育状况，包括沟通、粗大动作、精细动作、解决问题及个人-社会5个能区。每个能区各6道单选题，每道题回答“是”得10分、回答“有时是”得5分、回答“否”则不得分。每个能区得分范围为0～60分，ASQ-3问卷总分为300分。

1.3分组依据

ASQ-3问卷结果分为高于界值、接近界值和低于界值3种：①高于界值：说明孩子目前的发育符合其年龄水平；②接近界值：说明此能区的发育值得关注，建议加强训练1～2个月后筛查或监测；③低于界值：说明孩子需要于专业环境下进一步进行更加精确的评估。ASQ-3问卷各能区界值分别为：沟通能区15.64分，粗大运动能区21.49分，精细运动能区34.50分，解决问题能区27.32分，个人-社会能区21.73分。

根据中国常模将5个能区得分均高于界值的婴儿及其母亲归为神经发育良好组，将任一能区得分接近或低于临界值的婴儿及其母亲归为神经发育迟缓组。

1.4粪便收集及储存

对婴儿监护人进行采便培训后，由监护人分别于产后0天和产后第90天自行采集婴儿粪便于一次性无菌采便管中，-20℃暂存，随后转移至实验室置于-80℃冰箱待检。

1.5 16S rRNA测序及生物信息学分析

采用粪便DNA提取试剂盒(TIANamp Stool DNA Kit)提取粪便中微生物总DNA,对于A260/280在1.8～2.0的DNA,根据16S rRNA V3～V4可变区域通过上游引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCAG-3′)和下游引物806R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性2 min、94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s,循环35次后经过72℃终止延伸2 min。在Illumina NovaSeq平台上对DNA扩增子进行16S rRNA测序，采用bcl2fastq(v.1.8.4)软件处理原始测序数据，在切除、过滤和拼接后，通过Qiime2的dada2算法对序列进行去嵌合体、去重复、降噪，生成扩增子序列变体(amplicon sequence variants, ASVs)丰度表并以sliva 138数据库为参考数据库获得ASV注释信息，计算Alpha多样性指数。具体方法参考文献[7],测序由成都贝斯拜尔生物科技有限公司完成。

1.6统计学分析

使用SPSS 25.0统计学软件分析数据。对母亲及婴儿的身高(长)、体重以及部分Alpha多样性指数等服从正态分布的连续型定量资料采用均值±标准差描述，并采用两独立样本t检验比较分析；对不服从正态分布的菌门、菌科的相对丰度、部分Alpha多样性指数以及生产年龄、ASQ-3五个能区得分等资料以M(P25,P75)进行描述，采用秩和检验(Mann-Whitney U检验)进行两两比较；对于分娩类型、婴儿性别等分类资料，选用频率(%)描述、Fisher确切概率法进行比较。选用Spearman’s秩相关分析肠道菌群中的优势菌与ASQ-3五个能区得分之间的相关性。P<0.05提示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 ASQ-3问卷调查结果

神经发育迟缓组10名婴儿中，在沟通能区和粗大动作能区均有2人(7.14%)得分接近界值；在精细动作能区有3人(10.71%)得分接近界值；解决问题能区有2人(7.14%)接近界值，有1人(3.57%)低于界值；在个人-社会能力能区，有4人(14.29%)得分接近界值，而有1人(3.57%)得分低于界值。由表1可见，神经发育迟缓组婴儿在五个能区的得分均低于神经发育良好组，尤其在精细动作、解决问题和个人-社会能区得分差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2一般人口学资料

由表2可见，一般人口学指标两组间差异无统计学意义。

表1调查对象12月龄时《年龄与发育进程问卷第三版》得分[M(P25,P75)]

表2调查对象一般资料

或M(P25,P75)描述；分类资料用n(r/%)描述

2.3 16S rRNA测序结果

2.3.1肠道菌群Alpha多样性

如表3可见，出生第0天和出生第90天时，婴儿肠道菌群Alpha多样性在神经发育良好与神经发育迟缓组间差异均无统计学意义。

2.3.2肠道菌群物种组成

如表4和表5所示，婴儿出生第0天时，神经发育良好组厚壁菌门的相对丰度显著高于神经发育迟缓组(P<0.05),而变形菌门的水平则低于神经发育迟缓组(P<0.05);在出生第90天时，神经发育良好组中放线菌门、双歧杆菌科和肠球菌科的相对丰度高于神经发育迟缓组(P<0.05)。

表3婴儿肠道菌群Alpha多样性

描述，不符合正态分布的用M(P25,P75)描述

表4婴儿肠道菌群在门水平上的物种构成[M(P25,P75)]

表5婴儿肠道菌群在科水平上的物种构成[M(P25,P75)]

2.4肠道菌群与ASQ-3五个能区的相关性

如表6所示，出生第0天时，婴儿粪便中梭菌科的相对丰度与12月龄时期婴儿的沟通能区得分呈正相关(P<0.05),而与粗大运动能区的得分呈负相关(P<0.05);出生第90天时，婴儿粪便中的变形菌门和肠杆菌科的相对丰度与12月龄时期的沟通能区得分呈负相关(P<0.05),而丹毒梭菌科相对丰度则与粗大运动能区得分呈负相关(P<0.05)。

3、讨论

ASQ-3问卷可靠性高、实用性强。本研究中，12月龄时神经发育迟缓组婴儿在五个能区得分均小于神经发育良好组，其中精细动作、解决问题和个人-社会能区得分差异有统计学意义(P<0.05),说明本研究分组合理，能够反映两组婴儿在神经发育上存在差异。

表6婴儿肠道菌群优势菌门、科与12月龄时ASQ-3五个能区的相关性

Alpha多样性指数是反映微生物群落丰富度和均匀度的综合指标，主要与群落中微生物的数目和个体分配的均匀性有关。本研究发现，出生第90天时神经发育迟缓婴儿的肠道菌群Alpha多样性指数均高于神经发育良好婴儿，但差异无统计学意义。一般认为，肠道菌群越丰富、多样性越高会对人体健康产生积极、正向的影响，然而有研究表明肠道菌群多样性的增加并不一定对神经认知有利，Alpha多样性越高，儿童图像接受和语言表达能力得分越低[8]。因此，菌群的多样性并不能全面、准确地反映肠道菌群和神经发育水平之间的关联，还应结合婴儿肠道的群落结构共同探究。

本研究发现，不同神经发育水平的婴儿间肠道菌群的物种丰度有所差异。0天时神经发育水平良好的婴儿肠道内厚壁菌门相对丰度高于神经发育迟缓的婴儿(P<0.05),而变形菌门相对丰度较低(P<0.05);在出生第90天时，神经发育水平良好婴儿的放线菌门丰度更高(P<0.05)。其他研究也表明婴儿肠道内厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的分布在健康儿童和患有神经精神相关性疾病儿童间不同[9]。

进一步的相关分析发现，早期婴儿肠道菌群的组成与12月龄时神经发育结局存在一定关联。在出生后第0天时，婴儿肠道菌群中梭菌科的相对丰度与12月龄时期婴儿的沟通能区发育呈正相关，而与粗大运动能区的发育呈负相关。而在出生后第90天时，婴儿肠道菌群中变形菌门的相对丰度与沟通能区得分呈负相关。SORDILLO等[10]发现，梭菌目相对丰度与婴儿3岁时沟通能力和个人-社会能力发育延迟呈负相关，尤其是梭菌目下的毛螺菌科与婴儿神经发育间存在显著负相关。虽然本研究未从目水平上探讨微生物与神经发育的关联，但在科水平上发现梭菌目下梭菌科的相对水平与婴儿沟通能区和粗大运动能区的发育存在负向关联。该研究还发现肠杆菌科相对丰度与沟通能区得分呈负相关，本研究也证实了这一点。而有关变形菌门与神经认知方面的关联在动物实验和人群队列中都有阐述[11,12],说明肠道菌群中变形菌门与神经认知发育之间存在较强的关联，值得进一步关注。

综上，生命早期不同神经发育水平婴儿间肠道菌群的结构存在差异，而这种差异可能在12月龄时与其神经发育的水平有关。由于样本量有限，且未考虑到可能影响婴儿神经发育的其他因素，仅重点关注生命早期阶段肠道菌群的组成与神经发育之间的关联，本探索性研究的结论推广及应用受到限制。今后尚需要建立多中心大样本母婴队列，考虑及调查更加全面、广泛的人口学特征，借助多组学技术，进一步地从现象和机制中阐明肠道微生物与神经发育之间的联系。

参考文献:

[3]彭晨芮,王一媚,王斯栌,等.两歧双歧杆菌TMC3115促进生命早期肠道菌群构建及其对远期炎症性肠病的影响[J].四川大学学报(医学版),2022,53(5):834-841.

基金资助:国家自然科学基金青年基金(No.82204037);中国营养学会营养科研基金(No.CNS-Feihe2022-12);

文章来源:贾雯,刘美汛,周志谟等.生命早期肠道菌群与婴儿神经发育的关系初探[J].卫生研究,2024,53(02):250-256.