抽动障碍(tic disorder, TD)是一类儿童或青少年时期常见的神经精神障碍，表现为突然的、反复出现的、无节律的运动性或发声性抽动。根据《美国精神疾病诊断与统计手册》第五版(DSM-V)显示，学龄儿童发病率为0.3%～0.8%[1]。流行病学调查结果显示，我国有近1 000万儿童患有TD,且发病人数逐年增多[2]。

TD发病机制复杂，既往研究多围绕遗传、神经生化、免疫、社会心理等因素展开，但都无法全面解释本病机制[3]。随着相关研究的深入，已有学者证实肠道菌群(gut-microbiota, GM)与TD之间关系密切，肠道菌群紊乱可成为TD病理机制研究新的切入点[4,5,6]。

强志组方是阎兆君教授基于《黄帝内经》,根据志意辨证理论所创制的治疗TD的有效方剂，具有强志定意、安魂助勇的功效，临床治疗TD收效较佳[7]。强志组方治疗TD的机制尚未阐明，课题组前期研究已发现强志组方可作用于大鼠脑内多巴胺、去甲肾上腺素，从而缓解大鼠抽动症状[8,9]。但强志组方对TD大鼠肠道菌群影响的相关研究仍属空白。

本实验探索强志组方对TD模型大鼠肠道菌群、小肠组织病理、纹状体DRD1、DRD2的影响。从肠道菌群角度探讨强志组方治疗TD的可能机制，为从肠道菌群角度探究TD提供新思路。

1、实验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠42只，3～8周龄，体质量190～230 g, 购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0011。大鼠饲养于山东中医药大学动物实验中心SPF级动物房，温度：(20±2) ℃,湿度：(55±5)%;12 h光照/黑暗循环(8：00—20：00)。实验已通过山东中医药大学动物实验伦理审查委员会审批，批号：SDUTCM20220224001。

1.2 主要试剂

亚氨基二丙腈(美国Sigma公司，批号：317306);戊巴比妥钠(湖北鸿运隆生物科技有限公司，批号：150408);Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(美国New England Biolabs公司，批号：M0531S);天根磁珠法DNA提取试剂盒(美国Qiagen公司，批号：DP180427);伊红染液(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：G1001);苏木素染液(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：G1004);RIPA组织/细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司，批号：R0020);GAPDH 兔多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10494-1-AP);DRD1兔单克隆抗体(英国Abcam公司，批号：ab81296);DRD2兔单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，批号：SC-5303);辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体(北京中衫金桥有限公司，批号：ZB2301)。

1.3 主要仪器

Lllumina Novaseq6000(美国lllumina公司，批号：San Diego);PCR仪(美国BIO-RAD公司，批号：T100);组织脱水机(亚光医用电子技术有限公司，批号：ZT-12M型);石蜡包埋机(亚光医用电子技术有限公司，批号：YB-6LF型);垂直电泳仪、电转仪(武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：SVE-2型、SVT-2型)。

2、实验方法

2.1 药物制备

强志组方药物组成：制巴戟天9 g, 制远志9 g, 清半夏9 g, 山药24 g, 木香6 g, 茯神 24 g, 生白术18 g。加入药材量10倍纯水浸泡 30 min。中药使用砂锅煮沸后第一次煎40 min, 第二次煎 30 min, 将2次药液过滤后混合。1剂中药共计99 g, 制成生药质量浓度为1 g·mL-1的药液99 mL。硫必利片(江苏恩华药业股份有限公司，LY210105,每片100 mg, 每瓶100片)配制成质量浓度为2 g·L-1的混悬液。药物均置于4 ℃冰箱保存备用。

2.2 动物造模

将42只大鼠适应性喂养1周后随机分为两组，空白组7只，亚氨基二丙腈造模组35只。依据参考文献[8],按照300 mg·kg-1剂量对造模组大鼠进行腹腔注射，连续注射7 d, 制备抽动障碍大鼠模型。根据文献[10]的方法进行运动行为评分，评分标准如下：0分：安静或正常活动；1分：过度兴奋表现；2分：探索行为增加，不连续吸鼻；3分：不停跑动；4分：不停跑动伴惊跳。依据Diamond[11]方法进行刻板行为评分，评分标准如下：0分：无刻板行为；1分：旋转行为；2分：头和颈部过多垂直运动；3分：头、颈部的垂直运动和旋转行为；4分：头部侧摆合并头颈部的垂直运动过多。当运动行为与刻板行为评分均≥2分时，提示造模成功。

2.3 分组与给药

造模成功后的大鼠再随机分为模型组、硫必利组、强志组方低剂量组、强志组方中剂量组、强志组方高剂量组。从造模第8天开始灌胃给药，参考《药理学实验指导》[12]人鼠等效剂量计算给药量。硫必利组予以硫必利混悬液27 mg·kg-1,强志组方低、中、高剂量组分别按照4.455 g·kg-1、8.91 g·kg-1、17.82 g·kg-1水煎剂灌胃给药。空白组和模型组予以等量生理盐水灌胃，每日1次，连续干预28 d。

2.4 标本采集

标本采集前，大鼠禁食8 h, 根据大鼠体质量，按照2 mL·kg-1的剂量腹腔注射2%戊巴比钠溶液深度麻醉大鼠。打开腹腔，腹主动脉取血法采血，在大鼠胃下5 cm处取1 cm长的小肠组织，用生理盐水洗净后放入4%多聚甲醛固定瓶中常温保存。每组随机选取3只大鼠，在干净的操作台上，使用一次性无菌镊取每只大鼠结肠内粪便 2～3粒置于无菌冻存管中，急投液氮。将大鼠断头后，冰盒上剥离大鼠脑组织，取双侧纹状体，取材完成后保存于-80 ℃冰箱。

2.5 观察指标及标本检测

2.5.1 肠道菌群16S rDNA测序

使用TIANGEN磁珠法粪便基因组DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取大鼠粪便样本的总基因组DNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度与纯度，以稀释后的基因组DNA作为模板，对16S rDNA 中的V3-V4区进行PCR扩增。上游引物序列：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′;下游引物序列：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。配制PCR反应体系如下(30 μL):Phusion Master Mix(2×) 15 μL,Primer F(1 μmol·L-1)1 μL,Primer R(1 μmol·L-1)1 μL,gDNA 10 μL,ddH2O补足至 30 μL。配制完成后进行扩增，使用2%琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，对目的条带使用Universal DNA 纯化回收试剂盒进行回收。NEB NextTM Ultra DNA Library Prep Kit建库试剂盒用于文库构建，待文库合格后，使用NovaSeq 6000进行上机测序。得到测序结果后进行生物信息分析。

2.5.2 HE染色观察小肠组织病理

组织固定24 h, 修整、冲洗后使用脱水机按照程序进行脱水、透明、浸蜡。组织包埋完成后制作蜡块，进行切片、捞片与烤片。将石蜡切片按步骤进行脱蜡、苏木素染色、伊红染色、脱水封片。

2.5.3 Western blot检测纹状体DRD1、DRD2蛋白表达水平

RIPA组织裂解液提取纹状体蛋白，BCA法检测蛋白浓度后进行变性备用。使用制胶试剂盒制胶，待胶凝固后取下玻璃板放入电泳槽，设置恒压100 V、50 min进行电泳，然后以恒压100 V、80 min 条件转膜。转膜完成后将PVDF膜放入5%脱脂奶粉孵育盒中，室温下封闭2 h, 将PVDF膜按照Marker标记的位置进行裁剪后放入一抗，4 ℃过夜孵育(一抗稀释比例：DRD1:1/1 000;DRD2:1/200;GAPDH:1/5 000),二抗室温结合1 h(二抗稀释比例：1/5 000),孵育完成后，配制显影液进行显影。使用Image J软件分析条带灰度值，目的条带灰度值/内参灰度值，即目的蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 27.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组数据均值比较采用t检验，大于两组数据均值采用F检验(单因素方差分析),P<0.05表示差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1 强志组方对TD模型大鼠行为学的影响

3.1.1 各组大鼠运动行为评分比较

造模后，与空白组比较，造模组大鼠运动行为评分升高(P<0.001)。药物干预28 d后，与模型组比较，硫必利组大鼠运动行为评分降低(P<0.05),强志组方各剂量组大鼠运动行为评分显著降低(P<0.01),见表1。

3.1.2 各组大鼠刻板行为评分比较

造模前，各组大鼠未发现刻板行为。造模后，模型大鼠均出现不同程度的刻板行为(P<0.001)。药物干预 28 d 后，与模型组比较，硫必利组、强志组方低、中、高剂量组大鼠刻板行为评分明显降低(P<0.05),中药各剂量组比较无明显差异(P>0.05),见表2。

表1 各组大鼠运动行为评分比较

表2 各组大鼠刻板行为评分比较

3.2 强志组方对TD模型大鼠肠道菌群构成的影响

3.2.1 划分OTU

将测序结果中序列间碱基排列相似性大于97%的序列划分为一个OTU(可操作分类单元),每个OTU对应一种代表序列。空白组、模型组、硫必利组和强志组方低、中、高剂量组大鼠中分别有692、578、633、585、607和586种OUT。各组特有的OTU:空白组有154种，模型组有40种，硫必利组有95种，强志组方低剂量组有47种，强志组方中剂量组有69种，强志组方高剂量组有48种。OTU数值越大提示肠道菌群数量越多，模型组和各治疗组大鼠肠道菌群物种数量较空白组降低，说明TD造模后会影响大鼠肠道菌群物种数量，使大鼠肠道菌群物种数量减少。在经过药物干预后，肠道内菌群物种数量增加，与模型组比较，强志组方中剂量组与硫必利组增加幅度更大。见图1。

图1 Veen图  

3.2.2 α多样性分析

α多样性主要反映单个样本内物种的多样性。α多样性与物种丰富度(community richness)和多样性(community diversity)有关。描述菌群丰富度的指标包括Chao1指数和Ace指数，Chao1指数和Ace指数越大，代表样本的肠道菌群丰富度越高。多样性包括Shannon指数和Simpson指数。Shannon指数越高，说明样本菌群多样性越高。Simpson指数越大，说明样本菌群多样性越低。

与空白组比较，模型组Ace指数、Chao1指数、Shannon指数降低(P<0.01),Simpson指数升高，但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较，强志组方中剂量组、硫必利组Ace指数、Chao1指数、Shannon指数升高(P<0.05),强志组方低、高剂量组的Ace指数、Shannon指数升高(P>0.05),硫必利组、强志组方低、中、高剂量组Simpson指数有降低趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肠道菌群α多样性指数比较

3.2.3 β多样性分析

β多样性分析主要反映不同样本之间菌群群落是否具有差异性。通过 PLS-DA 图(最小二乘法判别分析图)展示各组大鼠肠道菌群间的β多样性。如图2所示，每一个点代表一个样本，不同颜色代表不同分组，距离越接近的样本，物种组成结构也越相似。可以看出空白组与模型组距离远，无交集，说明二者菌群微生物存在差异性；模型组与强志组方低、中、高剂量组无交集，说明模型组与中药干预组菌群微生物无关联，强志组方干预可以改变大鼠菌群群落结构。

图2 各组大鼠菌群分类学PLS-DA图  

3.2.4 菌群群落结构分析

3.2.4.1 门水平

本研究结果发现的主要优势菌门有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)。Firmicutes在各组中的相对丰度排列依次为空白组(20.89%)、强志组方高剂量组(18.42%)、强志组方中剂量组(17.29%)、硫必利组(15.50%)、强志组方低剂量组(14.00%)、模型组(13.89%)。Bacteroidetes在各组中的相对丰度排列依次为强志组方低剂量组(24.29%)、硫必利组(21.17%)、强志组方中剂量组(17.99%)、强志组方高剂量组(15.46%)、模型组(11.05%)、空白组(10.04%)。Proteobacteria相对丰度排列最高的为模型组(87.29%)。见图3。

图3 各组大鼠肠道菌群门水平上物种分布柱状图

3.2.4.2 属水平

本研究发现的主要优势菌属有乳酸杆菌属(Lactobacillus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、颤螺菌属(Oscillospira)、普雷沃菌属(Prevotella)。Lactobacillus在各组中的相对丰度排列依次为强志组方高剂量组(23.40%)、强志组方低剂量组(20.09%)、空白组(15.83%)、模型组(15.40%)、强志组方中剂量组(12.74%)、硫必利组(12.55%)。Ruminococcus在各组中的相对丰度排列依次为强志组方中剂量组(21.54%)、空白组(21.41%)、模型组(21.36%)、硫必利组(14.34%)、强志组方高剂量组(11.50%)、强志组方低剂量组(9.89%)。Oscillospira在各组中的相对丰度排列依次为强志组方高剂量组(26.86%)、强志组方中剂量组(21.03%)、空白组(16.14%)、硫必利组(15.07%)、强志组方低剂量组(11.28%)、模型组(9.62%)。见图4。

图4 各组大鼠肠道菌群属水平上物种分布柱状图  

3.2.5 LEfSe差异分析

当设定LDA阈值为2时，空白组排名前10位的优势菌为毛螺菌科(Lachnospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、普拉梭菌属(Faecalibacterium prausnitzii)、梭状芽胞杆菌门(Clostridiales)、毛螺菌属(Lachnospira)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳酸球菌(Lactococcus garvieae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、粪球菌属(Coprococcus)。硫必利组优势菌为S24-7菌科。强志组方低剂量组优势菌为拟杆菌属(Bacteroidales)、S24-7菌科。强志组方中剂量组优势菌为瘤胃球菌属(Ruminococcus)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、梭状芽孢杆菌门(Clostridiales)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拉氏丁酸球菌(Butyricicoccus pullicaecorum)、嗜糖梭菌(Clostridium saccharogumia)。强志组方高剂量组的优势菌有颤螺旋菌属(Oscillospira)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、嗜胆菌属(Bilophila)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、梭状芽孢杆菌门(Clostridiales)。模型组未能显示其差异显著物种，说明所有差异显著物种未在模型组中富集。原因可能是模型组肠道菌群的多样性与其他组比较不显著，或与其他组菌群之间的重叠性较大所致。如图5、图6,柱状图不同颜色代表不同组别，横坐标表示LDA得分值，LDA得分值越高表明差异性越显著，纵坐标代表差异分类单元。

3.3 强志组方对大鼠小肠组织病理学的影响

空白组肠道黏膜结构完整，杯状细胞排列整齐，腺体组织形态正常；模型组肠绒毛断裂，杯状细胞缺失，腺体被破坏，结构失去完整性；硫必利组肠黏膜部分脱落，腺体破坏；强志组方低、中、高剂量组肠黏膜结构较模型组改善，少量腺体破坏。见图7。

图5 LEfSe进化分支图   

图6 LDA Score 分布柱状图   

3.4 强志组方对大鼠纹状体DRD1、DRD2蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠DRD1、DRD2蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组比较，硫必利组DRD1、DRD2蛋白表达水平降低，但差异无统计学意义(P>0.05);强志组方低、中、高剂量组大鼠DRD1蛋白表达水平降低(P<0.05),强志组方中、高剂量组大鼠DRD2蛋白表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。见图8。将肠道菌群属水平上物种与纹状体DRD1、DRD2蛋白相对表达量进行Spearman相关性分析，结果显示在属水平上，Lactobacillus与DRD1呈正相关(r=0.519,P<0.05);Adlercreutzia与DRD2呈负相关(r=-0.577,P<0.05)。见图9。

图7 各组大鼠肠组织形态HE染色图(×200)   

图8 强志组方对TD模型大鼠纹状体DRD1、 DRD2蛋白表达的影响  

图9 DRD1、DRD2与菌群的相关性分析图   

4、讨论

《灵枢·本脏》言：“志意者，所以御精神，收魂魄，适寒温，和喜怒者也……志意和则精神专直，魂魄不散，悔怒不起，五脏不受邪。”《黄帝内经》早已明确了志意在精神、动作、行为驾驭、驭收、发用及对内外环境的感知、反馈、调适的生理作用[13]。阎兆君教授本于《黄帝内经》,从志意辨证角度出发，提出TD的病机为肾志不足，脾意任越，魂魄不安，自拟强志组方治疗TD,临床疗效显著。强志组方由制巴戟天、制远志、清半夏、山药、木香、茯神、生白术组成。巴戟天、远志可益肾增志；木香强志，理气健脾；茯神能开心益智，安定魂魄；清半夏可调和阴阳，行水气而润肾燥；白术健脾；山药益肾强志、安神魂、定精魄。诸药共奏益肾强志，安魂助勇之功效。肾志得充，患者志行相谐，对于肌肉、情感情绪控制力增强，则抽动得以缓解。

肠道菌群是存在于人体肠道的一组数量庞大、种类众多的微生物。肠道菌群通过化学信号、神经通路和免疫途径与大脑进行双向交流，在人体消化吸收、新陈代谢、免疫功能及器官发育等方面发挥重要作用[14,15],这一过程被称为“脑-肠轴”。现代研究发现肠道菌群在神经精神类疾病中扮演了重要角色，如抑郁症、帕金森病和阿尔兹海默病等。肠道菌群与TD之间的关系也越发受到关注，已有相关临床研究发现TD患者伴随肠道菌群和肠脑轴的异常[16]。动物实验研究也报道了肠道菌群在TD发病中发挥的重要作用。调控肠道菌群或许可以成为治疗TD的潜在靶点[6]。

有学者提出人体肠道菌群与“肾精”同源的观点，肠道菌群发挥的一系列作用与中医学“肾精”的生理功能高度相似[17]。首先，从起源上讲，二者均禀受于母体，起源于胚胎期。肾精禀受于父母结合的生殖之精。《灵枢·决气》记载：“两神相搏，合而成形，常先身生，是谓精。”明确了肾精的起源，在人出生之前即存在，是形成胚胎的物质基础。肠道菌群也始于胚胎期，研究发现在胎盘、胎粪、羊水中检测出与母体菌群相似的细菌，表明在胎儿与母亲之间有微生物的转移，且在产前肠道微生物定植过程已经开始[18]。从功能上讲，肾精与肠道菌群均介导神经系统发育，肾主骨生髓，脑为髓之海，肾精充足则髓海充盈[19];髓海不足，脑失所养，则出现健忘、痴呆、头晕等神经精神疾病。肠道菌群在人体早期发育过程中影响神经发育、血脑屏障、小胶质细胞的成熟等，同时通过神经-内分泌、免疫、代谢等作用于中枢神经系统，影响神经精神类疾病发生发展[20,21]。机体的肾精与肠道菌群都会随着年龄的增长发生变化。青壮年时期，人体肾精盛，脏腑阴阳调和，正气充足，抗病能力强。年老时肾精亏损，肾阴肾阳对五脏的滋润、温煦作用减弱，脏腑功能减退，机体抵御外邪能力降低。肾精影响机体的生、长、壮、老、已。青壮年时期，人体肠道菌群多样性丰富，菌群结构处于动态平衡，所以机体抵抗能力强，不易发病。随着年龄增加或感染疾病时，肠道菌群多样性降低，有益菌减少，致病菌增加，增加机体发病的可能性。由此可见，肾精与肠道菌群有密切的联系[22,23]。

强志组方从肾志入手治疗TD,其发挥作用的机制是否与肠道菌群相关?基于上述理论，本研究以肠道菌群为切入点，探讨强志组方治疗TD的作用机制。研究结果显示，经强志组方干预后，TD大鼠的运动行为评分与刻板行为评分明显降低，大鼠肠道菌群多样性与丰富度增加，肠道菌群结构发生变化，纹状体DRD1、DRD2蛋白表达水平降低，小肠黏膜形态结构改善。Spearman相关性分析结果提示，大鼠肠道菌群与纹状体DRD1、DRD2蛋白表达具有相关性。有动物实验研究报道，肠道菌群及其代谢产物可以通过肠脑轴调节大脑多巴与多巴胺的产生，影响大脑功能[24],且消化道及肠道菌群是体内多巴胺的重要来源[25]。基于“脑肠轴学说”,推测肠道菌群多样性及结构的变化，通过肠脑轴作用于多巴胺神经能，从而参与抽动症状的发生。但肠道菌群与DRD1、DRD2相互作用的具体机制还需进一步探索。

综上，强志组方能明显改善TD大鼠异常的运动行为和刻板行为，其作用机制可能与强志组方调控肠道菌群的结构与丰度，改善肠道屏障功能，同时降低纹状体DRD1、DRD2蛋白表达相关。

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基金资助:国家自然科学基金项目(81774249);志意辨证学术流派传承工作室项目{鲁卫函[2021]45号};济南市“高校20条”资助项目(2020GXRC013);

文章来源:詹婷,姜韫赟,王妹,等.强志组方对抽动障碍模型大鼠肠道菌群的影响[J].中医学报,2024,39(05):905-912.