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齐墩果酸激活GPR39对发育期脑损伤大鼠神经发育的影响

2024-05-29 44 上传者：管理员

摘要：目的研究齐墩果酸(OA)对发育期惊厥性脑损伤大鼠神经发育的改善作用及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为RS组(青霉素诱导大鼠模型)、RS+OA组(青霉素+20 mg·kg-1 OA)、RS+OA+GPR39 CRISPR组[青霉素+20 mg·kg-1 OA+5×108PFU的G蛋白偶联受体39(GPR39) CRISPR质粒]、RS+OA+EX527组[青霉素+20 mg·kg-1 OA+10 mg·kg-1的沉默信息调节因子1(SIRT1)抑制剂EX527],每组均为10只大鼠。通过神经发育实验、旷场实验及新异物实验检测大鼠神经发育、学习记忆能力；用免疫荧光染色检测小胶质细胞GPR39表达水平；用试剂盒检测氧化应激相关表达；用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)实验检测相关基因mRNA表达水平。结果 RS组、RS+OA组、RS+OA+GPR39 CRISPR组和RS+OA+EX527组的GPR39 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.05、1.29±0.14、0.97±0.11和1.05±0.09,SIRT1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.10、1.33±0.20、1.05±0.09和1.01±0.06,受体γ辅激活因子1α(PGC-1α) mRNA相对表达水平分别为1.00±0.16、1.34±0.15、1.03±0.07和0.93±0.11,核因子E2相关因子2(Nrf2) mRNA相对表达水平分别为1.00±0.08、1.45±0.21、0.89±0.10和0.96±0.08。RS组的上述指标与RS+OA组比较，RS+OA+GPR39 CRISPR组、RS+OA+EX527组的上述指标分别与RS+OA组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 OA可能通过GPR39激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路抑制氧化应激途径，改善青霉素诱导的发育期惊厥性脑损伤大鼠神经发育及学习记忆能力的影响。

关键词：
G蛋白偶联受体39
发育期惊厥性脑损伤
学习记忆能力
沉默信息调节因子1/受体γ辅激活因子1α/核因子E2相关因子2信号
神经发育
齐墩果酸
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惊厥，也称惊风、抽搐、抽筋等，是小儿发育时期较为常见的神经系统疾病，持续惊厥发作易造成脑损伤，威胁患者的生命[1]。目前，抗癫痫药物及苯二氮类药物常被用于治疗惊厥的发作，但该类药物的反复使用对发育期患儿认知、骨骼等发育具有一定影响[2]。齐墩果酸(oleanolic acid, OA)是一种存在于如大蒜叶、丁香等多种植物中的五环三萜类化合物。根据现代药理学研究表明OA具有显著的抗氧化等功效，且有研究表明OA在多种类型脑损伤疾病中具有积极的治疗作用，且药物不良反应发生率低[3]。本研究通过构建发育期惊厥性脑损伤大鼠模型，探讨OA治疗后对大鼠学习记忆能力、氧化损伤的影响及其机制。

一、材料与方法

1 材料

动物清洁级3周龄(21日龄)雄性SD大鼠，体质量(52.60±3.80)g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0006。本实验经南昌大学附属赣州医院动物伦理委员会批准(伦理批号：20231119)。

药品与试剂青霉素，规格：每支25 g, 纯度：98%,批号：230510,上海生工生物工程股份有限公司生产；齐墩果酸，规格：每瓶5 g, 纯度：97%,批号：230607,上海麦克林生化科技股份有限公司生产；沉默信息调节因子1(silence information regulatory factor 1,SIRT1)抑制药EX527,规格：每瓶5 mg, 批号：230711,上海源叶生物公司生产。活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(malonaldehyde, MDA)水平检测试剂盒，均购自北京百奥莱博科技有限公司；离子钙接头蛋白抗体-1(ionicalcin antibody-1,Iba-1)抗体，购自英国Abcam公司；G蛋白偶联受体39(G protein-coupled receptor 39,GPR39)抗体，购自上海户实医药科技有限公司；cy3标记的山羊抗兔二抗及FITC标记的山羊抗小鼠二抗，均购自上海齐源生物科技有限公司；Trizol试剂，购自上海昀冠机电设备有限公司。所有引物，均由上海生工生物工程股份有限公司合成和提供。

仪器Infinite M1000 Pro全波长多功能酶标仪，瑞士帝肯公司产品；NextGene QI96实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)仪，四川杰莱美科技有限公司产品；ZLDF-KY2倒置荧光显微镜，上海奋业光电产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[4]4]

用青霉素构建大鼠模型：取21日龄大鼠，每千克体质量腹腔注射500万单位的青霉素，于0、2、4、6、8和10 d每天注射1次(共6次),每次注射后30 min观察大鼠出现抽搐、蹦跳、不自主尖叫、四肢发抖等状况且持续30～40 min, 在注射6次青霉素结束后根据Racine分级(一级：眨眼、立须、咀嚼等面部肌肉抽搐；二级：颈部肌肉抽搐；三级：单侧前肢抽搐、阵挛；四级：双侧的前肢均出现抽搐并伴有身体立起；五级：身体背曲强直跌倒、双侧后肢强直),惊厥级别达到三级且持续超过30 min后恢复良好的大鼠即为建模成功。

2.2 动物分组与处置方法

将SD大鼠随机分为RS组、RS+OA组、RS+OA+GPR39 CRISPR组、RS+OA+EX527组，每组均为10只大鼠。其中，RS+OA组大鼠建模成功后腹腔注射20 mg·kg-1 OA,每日1次，连续4周；RS+OA+GPR39 CRISPR组大鼠建模成功后腹腔注射20 mg·kg-1 OA并尾静脉注射5×108 PFU的GPR39 CRISPR质粒(每周注射2次，连续注射4周);RS+OA+EX527组大鼠建模成功后腹腔注射20 mg·kg-1 OA和10 mg·kg-1 SIRT1抑制药EX527,每日1次，连续4周，注射间隔为2 h。对照组大鼠给予等量的0.9%NaCl处理。RS组在构建模型后给予等量的0.9%NaCl处理。给药第1天开始，每隔7 d称重，末次称重后收集脑组织备用。

2.3 神经发育实验检测大鼠神经功能[4]4]

在建模后第28天对各组大鼠神经发育反射进行测验。

前肢悬吊实验取铁丝，直径约为0.5 cm, 使铁丝固定在距离地面约50 cm处，下面放置软毯，轻轻将大鼠前爪握住铁丝，放开使大鼠保持前爪悬吊在铁丝上，记录大鼠悬吊时长。

负向趋地实验取长度约50 cm的粗糙木板置于与实验桌面呈45°夹角，并固定，将大鼠其头部朝向木板地面的一侧放置，记录从松开大鼠至大鼠调转头部完全朝向木板远离地面一侧的时间。

悬崖回避实验将大鼠平行地放置在试验台边缘的位置，记录松开大鼠后大鼠身体180°旋转或立即离开试验台边缘的时间。实验均重复3次取平均值。

2.4 旷场实验检测大鼠情绪反应[4]4]

自制无盖木箱，在木箱底部划线均分为25个小正方形，然后将大鼠置于木箱底部中间的格子中后松开大鼠，记录大鼠在5 min内穿越格子的数目，以及5 min内双前肢离地双后肢着地站立的次数和修饰胡须的次数。

2.5 新异物实验检测学习记忆能力[4]4]

各组大鼠均在建模后的第5、12、19、26天对大鼠进行该实验的学习和适应：将大鼠置于实验舱中自由活动60 min, 第2天将大鼠置于实验舱的中心，大鼠右、左各45°的距离放置2个一模一样的积木块(分别记为A和B木块),自由活动60 min熟悉积木块，在建模后第28天，将其中一积木块更换为颜色、大小等完全不一样的积木块(记为C木块),并将大鼠置于实验舱中心，记录大鼠探索木块A(或A周围5 cm)的活动时间及木块C(或C周围5 cm)的活动时间，计算认知指数[认知指数=探索木块C的时间/(木块A的时间+木块C的时间)]。

2.6 免疫荧光染色检测GPR39与小胶质细胞共定位情况[5]5]

取各组大鼠脑组织切片，进行常规石蜡切片，并常规脱蜡后，切片与兔抗Iba-1抗体或GPR39抗体混合在4 ℃下孵育过夜，次日用cy3标记的山羊抗兔二抗和FITC标记的山羊抗小鼠二抗在室温下孵育90 min, 然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)试剂进行染色细胞核(蓝色荧光)。在荧光显微镜下检测荧光信号。

2.7 试剂盒法检测氧化应激相关指标[6]6]

取各组大鼠脑组织，在4 ℃条件下加入0.9%NaCl进行组织匀浆(100 g·L-1),离心(1.2×104 r·min-1,10 min)后取上清液，用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度，并分别根据试剂盒操作步骤检测SOD、MDA、ROS水平。

2.8 RT-qPCR实验检测相关mRNA表达水平[7]7]

取各组大鼠脑组织，用Trizol试剂提取总RNA,并将提取的RNA(400 ng)逆转录为cDNA,配制体系，用荧光定量PCR仪进行扩增，结束后判定引物特异性，并以GAPDH为内参，计算相对表达水平。

3 统计学处理

用SPSS 23.0软件进行统计分析。所有数据均用表示，2组间比较用独立样本t检验，组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 体内抑制GPR39、SIRT1削弱齐墩果酸对发育期惊厥性脑损伤大鼠的神经保护作用

RS组建立发育期惊厥性脑损伤大鼠模型；RS+OA组大鼠建模成功后腹腔注射20 mg·kg-1 OA;RS+OA+GPR39 CRISPR组大鼠建模成功后腹腔注射20 mg·kg-1 OA并尾静脉注射5×108PFU的GPR39 CRISPR质粒；RS+OA+EX527组大鼠建模成功后腹腔注射20 mg·kg-1 OA和10 mg·kg-1的SIRT1抑制药EX527。

与RS组比较，RS+OA组大鼠7～28 d体质量及前肢悬吊时间、双后肢着地站立次数、水平穿越格子数、新异物识别认知指数均显著增加，负向趋地时间、悬崖回避时间、修饰胡须次数均显著降低(均P<0.05);与RS+OA组比较，RS+OA+GPR39 CRIPR组、RS+OA+EX527组大鼠7～28 d的体质量及前肢悬吊时间、双后肢着地站立次数、水平穿越格子数、新异物识别认知指数均显著降低，负向趋地时间、悬崖回避时间、修饰胡须次数均显著升高(均P<0.05,P<0.01),见表1和表2。

2 体内抑制GPR39、SIRT1对GPR39、SIRT1、PGC-1α、Nrf2 mRNA表达水平的影响

与RS组比较，RS+OA组大鼠GPR39、SIRT1、PGC-1α、Nrf2 mRNA表达水平均显著增加(均P<0.01);与RS+OA组比较，RS+OA+GPR39 CRIPR组、RS+OA+EX527组GPR39、SIRT1、PGC-1α、Nrf2 mRNA表达水平均显著降低(均P<0.01),见表3。

3 体内抑制GPR39、SIRT1削弱齐墩果酸对发育期惊厥性脑损伤大鼠氧化应激的作用

与RS组比较，RS+OA组大鼠SOD活性显著升高，MDA、ROS水平均显著下降(均P<0.01);与RS+OA组比较，RS+OA+GPR39 CRIPR组、RS+OA+EX527组大鼠SOD活性显著降低，MDA、ROS水平均显著提高(P<0.05,P<0.01),见表4。

表1 建模后各组大鼠体质量的比较

表2 各组大鼠神经发育实验、旷场实验数据及新事物认知指数的比较

表3 各组大鼠mRNA相对表达量的比较

表4 各组大鼠氧化应激功能的比较

三、讨论

本研究选取发育期SD大鼠，参考已有文献[5]报道，使用青霉素诱导惊厥性脑损伤大鼠模型，发现RS组大鼠体质量及前肢悬吊时间、双后肢着地站立次数、水平穿越格子数、新异物识别认知指数均降低，负向趋地时间、悬崖回避时间、修饰胡须次数均提高，这提示青霉素诱导的惊厥后神经发育、神经行为及学习记忆行为均受到显著影响。经OA治疗后，大鼠体质量及上述指标均得到改善，提示OA可改善发育期惊厥性脑损伤大鼠的神经发育、神经行为及学习记忆能力。

本研究观察到，经OA治疗后，惊厥脑损伤大鼠脑组织中SOD活性显著增强、ROS和MDA水平明显降低，此外，还观察到OA治疗后大鼠脑组织中GPR39和SIRT1、PGC-1α、Nrf2表达均明显上调，研究表明GPR39在海马等中枢神经系统组织中表达[8]。SIRT1/PGC-1α通路已被证实可参与多种中枢神经系统疾病[9],Nrf2作为SIRT1的下游基因可与SIRT1协同参与包括氧化应激在内的多种生物学过程[10]。本研究结果提示，OA可能通过介导GPR39激活SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路参与调节氧化应激在惊厥性脑损伤大鼠中发挥作用。

本实验观察到，抑制GPR39和SIRT1表达后，大鼠体质量及前肢悬吊时间、双后肢着地站立次数、水平穿越格子数、新异物识别认知指数均显著降低，负向趋地时间、悬崖回避时间、修饰胡须次数均显著升高，且抗氧化物质SOD活性明显下降，MDA和ROS水平均显著上升，这提示，抑制GPR39和SIRT1表达后可明显削弱OA对惊厥性脑损伤大鼠神经发育、神经行为、学习记忆能力的保护作用及氧化损伤的减轻作用。

本研究提示，OA可能通过抑制氧化应激途径，改善青霉素诱导的发育期惊厥性脑损伤对大鼠神经发育及学习记忆能力的影响，这可能与激活GPR39和SIRT1/PGC-1α/Nrf2通路相关。

参考文献:

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基金资助:博士科研启动基金资助项目(Bsqd2018004);