宫颈癌是妇女第四大常见的恶性肿瘤，严重威胁女性健康[1]。我国每年约有9万例宫颈癌新发病例和3万例死亡病例[2]。WHO公认， 持续性高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌发生、发展的主要危险因素[3], 尤其是HPV16亚型， 约占全球病例的54.4%[4]。所以， 加强对女性宫颈癌前病变的筛查尤为重要。目前， 液基细胞学检查、HPV DNA分型检测和HPVE6/E7 mRNA基因检测已成为宫颈癌筛查的重要检测方法， 但对病毒清除以及宫颈疾病恶化风险预测的效果可能不理想。事实上， 在所有HPV感染患者中， 只有大约1%的持续感染高危型HPV的女性会逐渐发展成宫颈癌[5]。了解人体阻止病毒侵袭的关键性防御措施， 将有助于避免临床的过度干预和治疗。已有研究证明， 利用重组重叠肽(recombinant overlapping peptide, ROP)技术能够更有效地刺激CD8+和CD4+T细胞免疫应答[6], 因此， 本研究将HPV16E7蛋白设计成多个酶切位点连接的ROP, 检测HPV16感染患者是否存在针对HPV的细胞免疫力， 并对其进行随访观察， 分析其细胞免疫力与病情发展的相关性， 探讨HPV细胞免疫力在病变风险评估及病情转归中的作用及临床价值。

1、资料与方法

1. 1 研究对象

选取2020年3—9月在常州市妇幼保健院宫颈疾病诊治中心进行宫颈机会性筛查的HPV16阳性患者为研究对象， 共131例， 年龄23～67岁， 中位年龄41岁。在研究开始时， 对所有患者进行阴道镜下活组织病理检查， 将患者分为慢性炎症组、低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)组、高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)组和宫颈癌组， 并采集患者外周血样本。排除标准： (1)患有其他免疫系统疾病； (2)近1个月内使用抗生素、激素等免疫抑制剂； (3)妊娠期。收集各组研究对象一般资料(年龄、初次性生活年龄、是否使用避孕套、孕产次、是否绝经), 组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究在数据收集前已获得医院伦理审查委员会批准， 所有患者均知情同意。

1. 2 主要试剂与仪器

4个覆盖HPV16E7蛋白全序列的重叠肽购自浙江鸿拓生物技术股份有限公司； LB液购自生工生物工程(上海)股份有限公司； 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)购自北京索莱宝科技有限公司； Ni-NTA树脂购自常州天地人和生物科技有限公司； 淋巴细胞分离液、RPMI 1640培养液购自天津灏洋华科生物科技有限公司； FBS购自依科赛生物科技有限公司。酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)试剂盒购自Mabtech公司， 抗IFN-γ-Ab预涂微孔板购自Millipore公司， ELISPOT读取器购自Immunodiagnostik公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 组织病理学检查

对于131例HPV16阳性患者， 均由常州市妇幼保健院宫颈科医生于阴道镜下取宫颈活体组织(厚度至少为3 mm), 统一交由病理科处理(甲醛固定， 石蜡包埋， 室温保存)。使用旋转切片机进行手动切片， 然后进行H-E染色。使用BX45 Olympus显微镜(Olympus公司)获取图像。经同一位组织病理学家审查， 根据宫颈有无病变及病变程度分为4组： 慢性炎症组； LSIL组， 包括宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)1和/或湿疣(CIN1/HPV); HSIL组， 包括CIN2和/或CIN3(CIN2/3)、原位癌； 宫颈癌组。

1. 3. 2 混合HPV16E7肽和ROP-HPV16E7

合成了4个覆盖HPV16E7蛋白全序列的重叠肽： 肽1, IRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP; 肽2, MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLND-SSEEE; 肽3, EQLNDSSEDEDEGPAGQAEPDR-AHYNIVTFCCK; 肽4, HYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMG。ROP-HPV16E7是一种人工蛋白， 包含与LRMK(组织蛋白酶S裂解位点)连接的E7重叠肽。表达和纯化ROP-HPV16E7: 将ROP-HPV16E7转化的质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3), 放入50 μg/mL卡那霉素中， 37 ℃培养过夜， 然后用新鲜的LB液稀释， 培养至600 nm波长处光密度值达到0.6。IPTG最终浓度为0.5 mmol/L。IPTG诱导16 h后离心收集细胞。将细胞微球重悬浮在裂解缓冲液[25 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl, 2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100), 10 mmol/L咪唑， pH值为8.0]中， 超声裂解， 收集可溶组分。将Ni-NTA树脂加入到可溶性组分中30 min, 然后用30树脂体积的裂解缓冲液洗脱， 用含有200 mmol/L咪唑的裂解缓冲液洗脱。洗脱后的蛋白质于4 ℃透析在含10%甘油的PBS中。

1. 3. 3 外周淋巴血的采集和处理

使用肝素钠真空采血管无菌抽取患者外周静脉血5 mL, 将血液等比例稀释后加入密度为1.077 g/mL的淋巴细胞分离液， 在18～25 ℃以1 500×g离心25 min, 提取PBMC云雾层， 用RPMI 1640培养液洗涤2次。根据PBMC计数情况， 用R10培养液稀释细胞悬液(RPMI 1640培养液∶FBS=9∶1), 并调整活细胞密度至2.5×106/mL, 备用。

1. 3. 4 HPV-T细胞免疫力的检测

使用ELISPOT进行检测。在包被有IFN-γ捕获抗体的微孔板上加入PBMC, 在此基础上， 阴性孔加入无血清培养液作为阴性对照， 检测孔加入特异抗原(ROP-HPV16E7)溶液， 阳性孔加入植物血球凝集素溶液， 在含有5% CO2的培养箱中孵育16～20 h。洗去细胞和抗原， 加入生物素化的针对IFN-γ的检测抗体， 室温下孵育2 h, 再与酶标记的抗生物素抗体室温孵育1 h。洗去未结合的抗体， 加入底物显色液显色， 干透后用ELISPOT读取器对斑点进行计数。结果判定： (1)“有反应性”。阴性孔斑点数为0～5个时， (检测孔斑点数)-(阴性孔斑点数)≥6; 阴性孔斑点数为6～10个时， (检测孔斑点数)≥2×(阴性孔斑点数)。(2)如果上述标准不符合且阳性指控对照孔正常时为“无反应性”。

1. 4 统计学处理

采用IBM SPSS 25软件进行统计分析， 定性资料以n(%)表示， 组间比较采用χ2检验， 检验水准(α)为0.05。

2、结果

2. 1 外周血HPV16E7特异性T细胞反应

本研究招募了131例HPV16型感染的女性患者， 在入组时分别进行外周血HPV16E7特异性T细胞反应和宫颈活组织病理诊断， 其中慢性炎症42例、LSIL 33例、HSIL 39例、宫颈癌17例。宫颈癌组患者中只有1例(5.9%)HPV16E7特异性T细胞反应阳性，显著低于其他3组(P<0.05)。详见表1。

表1 研究开始时不同病变程度组患者HPV16E7特异性T细胞反应情况  

2. 2 外周血低HPV16E7特异性T细胞反应与持续性病毒感染的关系

为了确定HPV16E7特异性T细胞反应是否与病毒持续感染有关， 1年后再次对患者进行HPV基因分型检测。慢性炎症组， 11例HPV16E7特异性T细胞反应阳性的患者中仅有2例(18.2%)HPV16持续感染， 而31例阴性反应的患者中有11例(35.5%)仍存在病毒感染， 持续感染率是阳性反应患者的1.95倍(P<0.05)。LSIL组， 14例HPV16E7特异性T细胞反应阳性的患者中有2例(14.3%)HPV16持续感染， 而19例阴性反应的患者中有12例(63.2%)仍存在病毒感染， 持续感染率是阳性反应患者的4.42倍(P<0.000 1)。HSIL组， 所有患者均接受病变组织切除手术治疗， 切缘均为阴性， 15例HPV16E7特异性T细胞反应阳性的患者中只有1例(6.7%)HPV16持续感染， 而24例阴性反应的患者中有8例(33.3%)仍存在病毒感染， 持续感染率是阳性反应患者的4.97倍(P<0.000 1, 表2)。这提示， 低HPV16E7特异性T细胞反应与HPV16的持续感染有关系。 

表2 研究开始和结束时，不同病变程度组患者HPV16E7特异性T细胞反应及HPV的检测  

2. 3 外周血HPV16E7特异性T细胞反应与组织病理结果的关系

经过1年的随访， 最后对入组患者进行宫颈活组织检查。结果显示， 在慢性炎症、LSIL、HSIL病例中， HPV16E7特异性T细胞反应阳性的患者均无组织病理学进展。在慢性炎症组， HPV16特异性T细胞反应阳性的患者组织病理检查好转率为81.8%, 是阴性反应患者(64.5%)的1.27倍； 特异性T细胞反应阴性的31例患者中有3例(9.7%)组织病理检查显示病情进展(P<0.001, 图1)。在LSIL组组织病理检查保持相同程度病变的患者中， HPV16特异性T细胞反应阴性的患者(31.6%)是阳性反应患者(14.3%)的2.21倍；HPV16特异性T细胞反应阳性的患者组织病理检查好转率为85.7%, 是阴性反应患者(68.4%)的1.25倍(P<0.01)。在HSIL组， HPV16特异性T细胞反应阳性的15例(100.0%)患者组织病理检查均未见病变， 而阴性反应的24例患者中有1例复发(P<0.05)。详见表3。

图1 3例进展期患者和1例好转型代表性患者的组织学图像  

表3 研究结束时， 宫颈活组织检查病理诊断

2. 4 外周血HPV16E7特异性T细胞反应与宫颈病变发展趋势的关系

共有114例患者完成了为期12个月的研究。在研究开始时， 所有患者HPV检测均为阳性， 其中40例(35.1%)患者HPV16E7特异性T细胞反应阳性， 其余74例(64.9%)患者的T细胞反应为阴性。在慢性炎症组、LSIL组、HSIL组患者中， HSIL组均进行了宫颈病灶切除手术治疗， 其余2组未进行干预治疗， 仅随访观察。1年后， 114例患者中有78例(68.4%)HPV检测阴性； 36例持续病毒阳性患者中， 经病理诊断， 3例(2.6%)进展， 其余33例(28.9%)仅持续感染， 并无病理进展。

在HPV16E7特异性T细胞反应阳性患者(n=40)中， 35例(87.5%)HPV转阴， 5例(12.5%)持续性感染， 并且在12个月内均无病理进展。而在HPV16E7特异性T细胞反应阴性患者(n=74)中， 43例(58.1%)清除了HPV16感染， 28例(37.8%)持续感染， 3例(4.1%)进展。在持续感染且无病理进展的患者(n=33)中， 5例(15.2%)患者HPV16E7特异性T细胞反应呈阳性， 28例(84.8%)则为阴性反应。3例进展患者HPV16E7特异性T细胞反应均为阴性。

3、讨论

HPV是一组双链DNA病毒， 高危型HPV通过上皮磨损处进入上皮细胞内， 可产生特异性病毒癌蛋白E6和E7, 使宿主细胞的抑癌基因p53和Rb失活或降解， 从而促进癌细胞的生长。高危型HPV DNA整合到宿主基因内， 是恶性转化的重要标志[7]。从高危型HPV感染到发生宫颈癌大约需要10年的时间[8]。几乎所有宫颈癌前病变及宫颈癌都与HPV感染有关， 但感染HPV并不一定导致恶性肿瘤的发生、发展。近年研究发现， HPV感染后的转归与机体免疫功能， 尤其是宫颈T细胞免疫功能密切相关。在感染初期， 高达80%～90%的HPV感染在2年内被清除[9], 这被认为是由于固有免疫和T细胞介导的适应性细胞免疫对早期病毒蛋白的应答。但仍有病毒可以在感染者机体细胞中长时间潜伏， 在持续性高危型HPV感染的过程中存在Th1/Th2漂移现象[10], 导致宫颈组织局部免疫应答异常， 机体免疫抑制逐渐加重， 大量免疫抑制因子， 可使CD8+T细胞增加， CD4+T细胞减少， 因而CD4+/CD8+比值降低， 机体的免疫功能受到损害[11,12,13], 病变细胞发生免疫逃逸， 促进癌前病变细胞增殖， 并随着病变级别的进展， T细胞亚群间平衡更加趋于紊乱， 免疫功能受损更加严重， 最终诱导宫颈癌的发生、发展。这表明， 宫颈癌的发生是HPV感染与免疫反应共同作用的结果[14], 其中T细胞免疫力的高低是监测宫颈癌发生的重要的特异性免疫指标。

现阶段，宫颈癌的有效预防需要对HPV感染者进行频繁的复查、阴道镜检查和可能的组织学诊断， 为了改进评估宫颈病变风险的方法， 本研究进行了HPV特异性免疫力检测， 目的是评价HPV特异性T细胞免疫在HPV16感染患者临床转归中的作用。在前期动物研究中， 对小鼠进行ROP-HPV16E7免疫注射， 然后再接种表达HPV16E7蛋白的癌细胞， 发现被免疫过的小鼠有较强的免疫应答， 延缓了癌细胞的生长速度。IFN-γ释放试验中ROP-HPV16E7蛋白可以有效检测HPV蛋白免疫小鼠中HPV16E7特异性T细胞反应[15]。

所以，本研究使用ROP-HPV16E7(LRMK连接的覆盖HPVE7序列[15]的重叠多肽)作为抗原剂来检测患者的特异性T细胞活性。目前， 一共对131例HPV16感染妇女进行了HPV16E7特异性T细胞免疫力检测。结果显示， 在病变组(LSIL、HSIL、宫颈癌)呈现出一种微小的趋势， 随着病变级别的升高， HPV16E7特异性T细胞反应阳性占比降低， 17例宫颈癌患者中特异性T细胞反应阴性率高达94.1%, 仅有1例阳性。而在LSIL组和HSIL组中， 特异性T细胞反应无明显统计学差异， 特异性T细胞反应是否与病情严重程度具有相关性， 有待进一步扩大样本量来证实。

然而，本研究的其他数据显示，HPV16E7特异性T细胞反应阳性的患者， 病毒感染的清除率以及组织病理检查好转率均高于阴性反应患者， 这表明特异性T细胞免疫反应与病毒清除和病变转归之间有关联。并且， 在HPV16E7特异性T细胞反应阴性的患者中， 有3例病理未见病变仅单纯HPV感染的患者， 经过为期1年的随访后发现有不同程度的病变进展(1例HSIL、2例LSIL); 相反， 在特异性T细胞反应阳性的患者中则不存在这一现象。因此， HPV16E7特异性T细胞免疫力检测在预测病变进展风险上能够提供有效的临床价值。之前就有相关研究报道， 特异性T细胞的高表达可降低头颈部癌症患者的治疗强度， 可作为预后良好的信号灯[16], 这与本研究有异曲同工之妙。

本研究的潜在局限性是，慢性炎症组的HPV16E7特异性T细胞反应阴性占比要显著高于LSIL组和HSIL组， 这与课题组前期预实验结果差异较大(单纯HPV感染患者间隔半年2次特异性T细胞反应检测均为阳性， 且HPV转阴); 另外， LSIL组以及HSIL组均无进展病例， 不能更全面地预测低级病变是否会向高级病变乃至侵袭性病变发展。之后的研究会继续增大样本量， 延长随访时间， 并在此研究结果的基础上， 继续监测入组患者的特异性T细胞反应及临床转归。

但是，本研究仍然具有一定的临床价值。初步研究结果表明，如果检测到良好的T细胞免疫， 那么预示HPV感染很可能会被清除； 在缺乏T细胞免疫的情况下， 应采取干预措施阻止其进展。这可以显著提高HPV感染的管理效率， 对目前接受指南建议筛查的人群以及筛查不足的人群都有好处。目前的宫颈癌筛查战略虽然使宫颈癌的发病率和死亡率大大降低， 但往往伴随着过度筛查和治疗， 给育龄妇女带来一定程度的经济和心理负担。而本研究的方法和结果支持特异性T细胞免疫力可用于监测HPV相关的人体免疫反应这一结论， 本研究方法可能成为一种评估免疫治疗效果及预后的有效方法。

目前，尽管有针对HPV的有效预防性疫苗可用， 且具有不可否认的效力， 但现有的疫苗只覆盖了已确定的200多种类型中最具致癌性的9种， 而且年龄限制于45岁以下的人接种。更重要的是， 疫苗的接种率仍然很低。况且， 针对已经感染HPV的患者， HPV疫苗不具有治疗作用。所以， 越来越多的研究者投入到治疗性HPV疫苗的研究中， 如从HPVE6和E7衍生的人工合成长重叠多肽(synthetic long overlapping peptide, SLP)治疗HPV感染的高级别外阴上皮内瘤变显示出80%的部分有效率和47%的完全消退； SLP与抗PD-1抗体联合治疗HPV16相关癌症显示出协同效应[17,18]。本研究结果支持了基于T细胞的免疫在遏制HPV感染中发挥重要作用的假说， 也为治疗性疫苗的研究提供了新的思路。

参考文献:

[8]谢建渝,谢家宁,虞柯静,等.孕妇高危型人乳头瘤病毒载量和持续时间与宫颈病变的关系[J].中国妇产科临床杂志,2015,16(6):550-552.

基金资助:江苏省卫生健康委科研项目(F202166);常州市“十四五”卫生健康高层次人才培养工程-领军人才(2022CZLJ030);常州市政策引导类计划(国际科技合作/港澳台科技合作)项目(CZ20230020);

文章来源:石笑瑜,周蓓蓓,来艺青等.HPV16特异性免疫应答评估宫颈病变风险及转归的临床研究[J].现代免疫学,2023,43(06):501-506.