宫颈癌是第4大常诊断的癌症，也是导致全球妇女死亡的第4大原因。宫颈癌主要包括宫颈鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌以及其他少见类型。近年，宫颈腺癌发病日益年轻化[1]。宫颈癌筛查以及人乳头瘤病毒疫苗的接种使得宫颈鳞状细胞癌的发生率及死亡率都呈下降趋势[2],但近30年，腺癌的发病率和死亡率却持续上升。人们对于腺癌的研究不足使得其预后较差[3],因此迫切需要找到更理想的生物标志物为宫颈腺癌的早期发现和治疗提供依据。

性激素与妇科疾病的发生发展密切相关。在妇科恶性肿瘤中，既往人们对于雌孕激素的研究相对较多[4],雄激素较少涉及。雄激素是一类属于核受体超家族的类固醇激素，越来越多的证据表明低于或高于正常水平的雄激素也会对女性生殖系统产生不利影响。雄激素发挥作用主要依靠于雄激素受体(androgen receptor, AR)。循环中的雄激素与AR结合时，后者与热休克蛋白解离，并转运至细胞核[5]。在妇科肿瘤方面，已有研究发现叉头框转录因子A1(forkhead box A1, FOXA1)可以通过AR参与的Notch通路促进子宫内膜癌细胞增殖[6];在卵巢癌中，有研究发现雄激素与非浆液性卵巢癌风险增加有关[7]。然而，人们对于AR与宫颈癌之间的关系探索有限。

腺癌是一类来源于腺体、导管或分泌上皮的恶性肿瘤，由于具有相似的组织学基础，腺癌通常表现出类似的生物学行为。AR在其他腺癌中已有研究，如抗雄激素治疗对于高表达AR的无法手术或者远处转移的原发性皮肤顶泌腺癌(primary cutaneous apocrine carcinoma, PCAC) 有效[8]。同样有研究发现，对于复发性和远处转移的涎腺导管癌(salivary duct carcinoma, SDC)和高级别腺癌，雄激素剥夺疗法具有一定治疗效果[9]。另有回顾性分析发现，免疫组化结果显示46%的泪腺导管腺癌患者AR阳性[10]。基于相似的组织学基础，我们提出科学假设，即宫颈腺癌中也有类似的AR表达水平，并且可能与宫颈腺癌的预后相关。

1、资料与方法

1.1 一般资料

本回顾性队列研究纳入了2013—2021年间在南京大学医学院附属鼓楼医院妇科，接受宫颈腺癌根治术且术后病理提示为宫颈腺癌的86例患者，纳入标准为组织学分类为宫颈腺癌且术前未接受放疗或化疗的患者。同时，纳入了30例因子宫腺肌症等良性疾病而接受全子宫切除术的患者作为对照。本研究经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准。

所有患者的主要治疗方式均为根治性子宫切除术加盆腔淋巴结切除术。无病生存期(DFS)是指从手术之日到确诊复发之日或最后一次随访之日这段时间，总生存期(OS)是从手术之日到死亡之日或最后一次随访之日这段时间。

1.2 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色是在福尔马林固定、石蜡包埋的宫颈腺癌组织样本上进行的。所有样本均来自南京大学医学院附属鼓楼医院病理科妇科档案室，并在纳入本研究前进行了重新评估。从每个石蜡包埋组织块上切下厚度为4 μm的组织切片，放在载玻片上。玻片在65 ℃的通风烘干箱中烘干40 min, 然后用二甲苯和乙醇脱蜡。用柠檬酸缓冲溶液在120 ℃高压锅中煮沸2 min, 进行抗原修复。将玻片放入3% H2O2溶液中室温孵育8 min, 以阻断内源性过氧化物酶的活性。为了使核膜破裂，载玻片在 0.03% Triton溶液中孵育30 min。为了避免非特异性染色，用5%的山羊血清进行封闭。载玻片与一抗(AR抗体1∶100 稀释；CST:5153S)在4 ℃下孵育过夜。磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗切片后，用HRP结合的二抗(中国泰盈公司)在室温下孵育30 min, 用DAB显影抗原信号，并用苏木素复染。乙醇和二甲苯梯度透化后，切片用中性树脂密封在显微镜下观察。每种免疫染色的判读均由两名病理学家单独评估，然后一起对所有病例的判读达成共识。根据免疫染色的强度和数量，对宫颈癌细胞中的蛋白质染色进行了免疫反应评分(IRS)。细胞质和细胞核部分的亚细胞定位和染色水平按染色强度分为阴性(0分)、轻度(1分)、中度(2分)和重度(3分)。此外，阳性细胞的百分比分为 0分(无阳性细胞)、1分(<10% 阳性细胞)、2分(10%～50% 阳性细胞)、3分(51%～80% 阳性细胞)和 4分(>80% 阳性细胞)。IRS分数由这两个单项分数相乘得出。

1.3 统计学处理

统计分析使用的是SPSS 26版软件(IBM Germany GmbH, Ehningen, Germany)。临床病理参数与AR表达之间的相关性分析采用皮尔逊卡方检验。应用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线确定AR质核比率的截断值(cut- off value)及评估其诊断价值，ROC曲线下面积(area under curve, AUC)<0.5代表无诊断价值，0.5≤AUC<0.7代表诊断价值较低，0.7≤AUC<0.9代表诊断价值中等，AUC≥0.9代表诊断价值较高。采用Kaplan- Meier法绘制生存曲线，并进行对数秩检验，比较观察到的差异是否具有统计学意义。建立Cox比例风险模型以确定肿瘤远处转移的独立预后因素。P<0.05时为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 宫颈腺癌和正常宫颈组织中AR的差异表达

本研究使用IRS规则评估了宫颈腺癌组织和正常宫颈组织细胞质和细胞核中AR的染色情况，比较了两组表达模式的差异(图1)。研究发现在83.3%(25/30) 正常宫颈组织中AR呈核阳性，而细胞质中未见AR表达，典型的免疫组织化学染色如图1A～D,AR作为核受体入核发挥转录因子的作用。然而，我们在宫颈腺癌组织中却观察到了其不同于正常宫颈组织的表达模式：AR只在细胞核中表达的概率较低5/81(6.0%),同时我们发现10/81(12.0%) 只在细胞质中阳性表达，66/81(82.0%)同时表达，5/86(6.0%) 的患者AR核质表达均为阴性。这个现象提示我们宫颈腺癌的发生可能与肿瘤细胞AR表达缺失有关，也可能与AR入核失败有关。图1E～H显示的是细胞核AR弱阳性，细胞质阴性；图1I～L为二者均阳性；图1M～P为细胞核阴性，细胞质强阳性；图1Q～T为两者均阴性。

图1 宫颈腺癌和正常宫颈组织中AR免疫组织化学染色的代表性图像

2.2 患者的临床病理特征

基于此发现，本研究首先关注了单一核表达患者的病理结果，发现此类病人几乎均无淋巴结转移情况，而80%(8/10)单一胞质表达的患者病理报告了不同程度的淋巴结转移。基于以上两种截然不同表达模式的患者呈现出的两极分化的病理特征，作者进一步计算了肿瘤组66例AR核质同时表达的组织细胞质细胞核AR评分的比率，采用ROC曲线所得截断值2.5将66例患者分为比率≤2.5组和比率>2.5组，分析质核比率对患者各项临床病理特征的影响。本研究首先确定了两组间在临床基线数据年龄上无差异，结合患者的临床特点分析发现，比率>2.5组比比率≤2.5组有着更多的淋巴结阳性患者(76.9%vs 23.1%,P<0.01),和更多深肌层浸润的患者(76.5%vs 23.5%,P<0.01)。AR或与上皮- 间质转化(epithelial- mesenchymal transition, EMT)相关，因此作者分析了EMT相关蛋白波形蛋白与二者比率的关系，结果显示，比率>2.5组波形蛋白阳性率更高(78.3%vs 21.7%,P<0.01)。见表1。

表1 肿瘤特征与 AR 比率之间的相关性

2.3 AR细胞质- 细胞核比率的预后相关性

本研究获得了所有66例患者的生存数据，其中 64 例患者(96.9%)仍然存活。接下来分析了 AR 细胞质- 细胞核比率对患者预后的影响。由于在本院接受治疗的患者预后良好，本研究仅分析了DFS的差异，发现AR细胞质-细胞核比率较高患者的DFS明显较短(P<0.01)。比率≤2.5患者的中位生存期为123个月，而比率>2.5的患者仅为72个月(图2)。

根据Cox比例风险模型显示，AR比率是宫颈腺癌远处转移的独立危险因素[风险比(HR)=14.044,95%CI:3.160～62.429,P=0.001](表2)。

2.4 AR细胞质- 细胞核比率的诊断价值

ROC曲线分析结果提示，宫颈腺癌肿瘤组织中的AR细胞质- 细胞核表达比率对于患者预后的预测价值较高，AUC为0.920(95%CI: 0.858～0.982),敏感性为93.1%,特异性为75.7%,P<0.001。

图2 根据宫颈腺癌患者AR亚细胞定位情况绘制的DFS Kaplan- Meier图

3、讨论

本研究通过免疫组织化学分析了AR在宫颈腺癌中的预后价值，认为综合评估肿瘤组织AR的细胞质、细胞核表达情况，能在一定程度上预测肿瘤的生物学行为和判断患者预后。本研究发现AR的高质核比与肿瘤的淋巴结转移及更深层次的肌层浸润相关，同时与EMT相关蛋白波形蛋白的表达相关；AR胞质高表达患者的DFS较差。这些发现表明腺癌肿瘤组织腺上皮细胞质核比或可作为宫颈腺癌的预后标志物，AR细胞质表达占主导的患者应该是我们重点监测，必要时在术中给予淋巴结清扫的对象。

生理条件下，睾酮作为共同前体可以在芳香化酶和5α- 还原酶等关键酶的作用下转化成活性雌激素或雄激素。然而有研究表明，与正常宫颈组织相比，芳香化酶在宫颈癌中的表达量更高，5α- 还原酶在宫颈癌中的活性也会降低[11,12]。综合上述研究发现在宫颈癌患者体内类固醇激素代谢酶活性发生了较大变化，这就必然伴随着雌雄激素水平的改变，尤其是雄激素。对182例宫颈癌患者的癌症基因组图谱进行新一代测序(next- generation sequencing, NGS)分析的结果提示，7%的患者发生了AR的扩增、突变及缺失[13],这提示AR在宫颈癌中具有值得我们注意的未知意义。既往已有研究发现AR在所有正常宫颈上皮及低级别鳞状上皮内病变(low- grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)中表达，而在高级别鳞状上皮内病变(high- grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)及侵袭性鳞形细胞癌AR核表达缺失[14]。对于AR在正常宫颈上皮和LSIL与鳞形细胞癌中的表达差异，另有一项研究也表明阴道内长期给予脱氢表雄酮能有效促进LSIL消退[15]。以上研究均表明，由正常宫颈向宫颈恶性肿瘤的转变过程中往往伴随着宫颈上皮细胞AR表达的变化，本研究结果与之基本一致，但也存在一些局限性，以上研究对于AR表达的判定均限定在核染色，基于本研究结果认为核质染色的同时评价能更好地开发AR在宫颈腺癌的诊断价值。

表2 宫颈腺癌患者预后因素与生存期关系的单变量和多变量 Cox 回归分析

在真核细胞中，细胞质和细胞核被核膜分隔开。胞内大分子可以在核孔复合物(nuclear pore complexes, NPC)和核转运受体(nuclear transport receptors, NTRs)的辅助下发生核转运参与细胞过程，这有赖于特定信号序列如核定位信号(nuclear localization signal, NLS)或核输出信号(nuclear export signal, NES)等信号序列的调控[16]。非常规细胞核质转运过程的失调会导致某些特定货物蛋白的定位转移，与肿瘤发生密切相关。在缺乏雄激素的情况下，AR的NES较NLS更活跃，促进了AR的核质穿梭[17]。循环雄激素在宫颈癌发生后或会发生显著变化，这可能促使AR失去传统的核表达模式，更多的表达在细胞质从而较少或无法参与经典的雄激素- AR信号转导通路，而该通路在肿瘤发生过程中有其独特的作用。

侵袭和转移是晚期宫颈癌患者的主要特征和死亡原因[18]。临床研究发现，与宫颈鳞形细胞癌相比，宫颈腺癌的淋巴结阳性率更高，且淋巴结阳性患者生存率更低[19]。肿瘤细胞获得转移潜能和其运动性的增强主要是通过EMT这一过程[20]。作为转录因子，AR与双氢睾酮结合后转移到核。它与DNA上的激素反应元件结合，调节多种涉及细胞增殖和分化的基因[21]。本研究发现AR在宫颈腺癌中的表达模式不同于正常宫颈组织，并且与特定的临床病理特征相关，这使我们对于在正常宫颈组织和宫颈腺癌组织亚细胞定位截然不同的AR所行使的生物学功能产生兴趣。已有研究表明，在前列腺癌中肿瘤上皮细胞AR的表达水平与雄激素介导的EMT呈负相关，并影响E- cadherin、β- catenin及N- cadherin等的表达谱，从而抑制前列腺癌细胞的EMT、迁移以及侵袭等过程[22,23];同样在前列腺癌中，有研究还发现在高表达AR的前列腺癌干祖细胞中，AR能通过调节AKT细胞信号通路降低N- Cadherin、Vimentin、Snail等的表达，而E- cadherin表达增加，从而在EMT过程中发挥抑制作用[24]。本研究结果及猜想与以上研究结果相符。

雄激素与AR结合激活靶基因的表达除通过经典的雄激素- AR信号转导通路以外，非基因调控性AR信号转导通路也发挥重要作用，而此非经典过程恰恰是由胞质内AR介导。一些研究成果均表明AR的胞质表达同样具有相应的生物学效应，且其在肿瘤发展过程中对于肿瘤细胞的增殖、侵袭以及转移方面的作用是不可忽略的[25,26,27]。

核细胞蛋白与肿瘤发生的高度相关性使得其作为疾病治疗靶点开发的意义重大。现已基本可以证明相对于非肿瘤细胞，肿瘤细胞因其高增殖高代谢的需求对核转运机制的抑制更为敏感。本研究支持这样的猜想，在宫颈腺癌中我们更期望AR通过经典信号通路在核内行使功能，因此恰当的核输出抑制剂或许有一定的临床应用前景。同时，对在细胞质中通过非经典信号通路发挥促侵袭作用的AR,使用c- Src抑制剂阻断其功能或将对AR高胞质表达的宫颈腺癌患者预后产生有利影响。

在临床工作中或许可以依赖术前诊断宫颈腺癌组织样本的AR水平来预测肿瘤行为，并对患者进行分层从而给予个性化治疗，使得盆腔淋巴结清扫等侵入性治疗可以限制在AR表达水平较低、死亡风险更高的患者身上。

本研究回顾了8年间来本院行手术治疗的宫颈腺癌患者的临床病理信息，然而由于宫颈腺癌相较鳞癌较低的发病率，我们的病例数仍然相对不足，这是本研究的一个局限性。我们将努力开展更为广泛的多中心合作研究，这将使得我们的研究结论更具说服力。

4、结论

综上所述，本研究表明宫颈腺癌中AR的细胞质表达与患者的淋巴结转移情况密切相关，是宫颈腺癌患者预后不良的独立因素。这一发现可能对临床上识别高风险病人优化手术治疗方式有益，同时可以引起人们对于新的宫颈癌治疗药物开发的注意。

参考文献:

[4]封旭,蔡云朗,沈杨.雌激素受体亚型对妇科疾病影响的研究进展[J].东南大学学报(医学版),2013,32(5):651- 654.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81972434,82172819);

文章来源:郭祺,王露露,颜童,等.宫颈腺癌患者细胞质-细胞核AR表达比率的预后意义[J].东南大学学报(医学版),2024,43(03):329-336.