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红景天苷对关节软骨细胞炎性损伤的影响

2024-12-03 68 上传者：管理员

摘要：目的探究红景天苷(Sal)对关节软骨细胞炎性损伤的影响。方法将人关节软骨细胞分为对照组(常规培养)、IL-1β组(50 ng/mL)、Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组，Sal+GW0742组(8μmol/L Sal+4μmol/L CCL2-CCR2信号轴激活剂GW0742)。采用50 ng/mL IL-1β处理人关节软骨细胞以建立关节软骨细胞损伤模型。MTT法检测Sal及GW0742对关节软骨细胞的毒性；平板克隆实验、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡；ELISA检测炎症相关因子(IL-10、TNF-α、IL-6)水平；qRT-PCR检测CCL2、CCR2mRNA表达；Western blot检测增殖、凋亡相关蛋白(PCNA、Cleaved Caspase-3)及CCL2-CCR2信号轴蛋白表达。结果相较于对照组，IL-1β组集落形成数、IL-10、PCNA表达降低，凋亡率、TNF-α、IL-6、CCL2、CCR2mRNA及Cleaved Caspase-3、CCL2、CCR2表达升高(P<0.05);相较于IL-1β组，Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组集落形成数、IL-10、PCNA表达依次升高，凋亡率、TNF-α、IL-6、CCL2、CCR2mRNA及Cleaved Caspase-3、CCL2、CCR2表达依次降低(P<0.05);CCL2-CCR2信号通路激活剂GW0742可减弱Sal对IL-1β诱导的关节软骨细胞炎性损伤的保护作用(P<0.05)。结论 Sal可能通过抑制CCL2-CCR2通路，从而抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡和炎症反应。

关键词：
CCL2-CCR2信号轴
关节软骨细胞
凋亡
炎症
红景天苷
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骨关节炎(OA)是一种影响关节软骨的慢性炎症性疾病，其特征是关节软骨进行性和不可逆的退化，特别是软骨丢失和愈伤组织形成[1]。研究表明，OA病理机制复杂，包括衰老、创伤性炎症、代谢紊乱和遗传因素[2]。目前常用的消炎镇痛药虽然可以减轻或控制症状，但不能长期服用[3]。红景天苷(Sal)是红景天的生物活性物质，具有多种药理作用，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗细胞凋亡和免疫调节等[4]。Sal可以刺激骨形成并限制骨吸收，通过激活AMPK进一步改善膝骨关节炎[5]。Sa等[6]发现，Sal通过抗炎和抗氧化作用抑制滑膜炎症并缓解OA大鼠的急性症状。CC趋化因子配体2(CCL2)-C-C趋化因子受体2(CCR2)信号轴已被证明可以调节OA中的单核细胞募集、炎症和软骨破坏[7]。研究发现，抑制CCL2-CCR2信号轴的激活，可抑制关节炎症、软骨损伤和OA的进展[8]。Sal能够通过降低CCL2表达，抑制巨噬细胞趋化性及肺上皮细胞凋亡[9]。Sal是否可能通过调节CCL2-CCR2信号轴，减轻IL-1β诱导的关节软骨细胞炎性损伤?本研究拟通过建立IL-1β体外诱导关节软骨细胞损伤模型，探讨Sal对IL-1β诱导的关节软骨细胞炎性损伤的影响及潜在作用机制。

1、材料和方法

1.1细胞来源

人关节软骨细胞(GN-H094)来源于上海盖宁生物科技有限公司。

1.2主要试剂与仪器

红景天苷(S817419-20 mg,南京赛泓瑞生物科技有限公司);CCL2-CCR2信号轴激活剂GW0742(317318-84-6,美国Sigma公司);BCA蛋白质定量试剂盒(BES-20770CBR,上海博尔森生物科技有限公司);MTT试剂盒(M1020,江西江蓝纯生物试剂有限公司);M5 HiPer Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(JC-A80300,上海机纯实业有限公司);IL-10、TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒(QY-R0066、QY-WR0122、D6050,上海岑特生物科技有限公司);蛋白提取试剂盒(MBP0314-100T,上海毕合生物化学技术有限公司);兔源一抗GAPDH(ab181602)、PCNA(ab92552)、Cleaved Caspase-3(ab2302)、CCL2(ab315478)、CCR2(ab313463)、HRP标记IgG(ab302644)二抗，英国Abcam公司；流式细胞仪(DxP Athena,美国Cytek公司);酶标仪(Infinite F50,上海桑晒生物科技有限公司);qPCR仪(7500型，美国ABI公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养：

将软骨细胞在含有10 % FBS和1 %青霉素-链霉素的DMEM培养基中常规培养。每2 d更换新鲜的培养基。在达到80 %～90 %融合度时进行实验。

1.3.2 MTT法检测Sal及GW0742对关节软骨细胞的毒性：

将关节软骨细胞接种于96孔板中(5×104个/孔),培养24 h。分别用浓度范围为0、1、2、4、8μmol/L Sal[5]及0、1、2、4、8μmol/L GW0742[10]处理24 h,每孔加入20μLMTT(0.5 mg/mL)室温孵育4 h。加入150μL DMSO,充分振荡。测量570 nm处光密度(OD)值。

1.3.3 IL-1β诱导与分组：

将人关节软骨细胞分为对照组(用单纯的DMEM培养基培养)、IL-1β组(50 ng/mL)、Sal-2μmol/L组、Sal-4μmol/L组、Sal-8μmol/L组，Sal+GW0742组(CCL2-CCR2信号轴激活剂，4μmol/L)。除对照组外，其余各组均用50 ng/mL的IL-1β[11]处理；Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组用2、4、8μmol/L的Sal处理；Sal+GW0742组用8μmol/L的Sal和4μmol/L的GW0742处理。

1.3.4平板克隆实验：

将各组细胞接种于6孔板中(1×103),在37℃、5 % CO2培养箱培养14 d,用4 %多聚甲醛固定细胞15 min,用0.1 %结晶紫溶液染色30 min, PBS缓冲液洗涤细胞。最后，使用集落形成细胞分析系统对细胞集落进行成像和计数。

1.3.5流式细胞术：

收集细胞，用PBS冲洗后，离心5 min,弃上清。加入500μL结合缓冲液重悬细胞。依次加入5μL膜联蛋白V-FITC和5μL碘化丙啶(PI)轻轻混合，室温下避光孵育10 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6 IL-10、TNF-α、IL-6水平检测：

收集各组细胞培养上清液，根据ELISA试剂盒说明书制作标准曲线，酶标仪检测波长450 nm处的吸光度，计算上清中的IL-10、TNF-α、IL-6的水平。

1.3.7 qRT-PCR检测细胞中CCL2、CCR2mRNA表达：

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,使用Prime ScriptTMRT试剂盒在37℃15 min, 85℃5 s条件下合成cDNA。然后用SYBR Premix Ex TaqⅡ检测CCL2、CCR2和GAPDH的表达水平。引物序列见表1。热循环条件为：95℃3 min; 95℃5 s, 60℃30 s;最后72℃处理30 s,循环40次。采用2-ΔΔCT法进行定量，以GAPDH作为内源性对照。

1.3.8增殖、凋亡及CCL2-CCR2信号轴相关蛋白表达检测：

通过含有PMSF的RIPA裂解细胞中提取总蛋白，并通过BCA定量。用10 % SDS-PAGE分离约30 mg蛋白样品并转移到PVDF膜上。5 %脱脂牛奶封闭PVDF膜，并与一抗PCNA(1∶2 000)、Cleaved Caspase-3(1∶2 000)、CCL2(1∶2 000)、CCR2(1∶2 000)在4℃下过夜，将膜在室温下在二抗HRP偶联的抗兔IgG(1∶3 000)中孵育2 h,并用TBST洗涤。ECL发光液显影。Magepro Plus 6.0对蛋白质进行定量。

表1引物序列

1.4统计学处理

实验数据用Graphpad Prism 9.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料以表示。多组间的比较用单因素方差分析，SNK-q检验用于两组间的比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 Sal及GW0742对关节软骨细胞的毒性

0、1、2、4、8μmol/L的Sal对关节软骨细胞均无明显毒性，本研究选择2、4、8μmol/L Sal做后续实验；0、1、2、4μmol/L的GW074对关节软骨细胞无明显毒性，8μmol/L的GW074处理后，关节软骨细胞OD570降低(P<0.05),故选择4μmol/L的GW074做后续实验。见表2。

表2Sal及GW0742对关节软骨细胞OD570的影响

2.2 Sal对关节软骨细胞增殖的影响

相较于对照组，IL-1β组关节软骨细胞集落形成数降低(P<0.05);相较于IL-1β组，Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组关节软骨细胞集落形成数依次升高(P<0.05);相较于Sal-8μmol/L组，Sal+GW0742组关节软骨细胞集落形成数降低(P<0.05)。见图1和表3。

图1各组细胞集落形成数比较

表3各组细胞集落形成数比较

2.3 Sal对关节软骨细胞凋亡的影响

相较于对照组，IL-1β组关节软骨细胞凋亡率升高(P<0.05);相较于IL-1β组，Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组关节软骨细胞凋亡率依次降低(P<0.05);相较于Sal-8μmol/L组，Sal+GW0742组关节软骨细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图2和表4。

2.4 Sal对上清中IL-10、TNF-α、IL-6的影响

相较于对照组，IL-1β组上清中IL-10降低，TNF-α、IL-6升高(P<0.05);相较于IL-1β组，Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组IL-10升高，TNF-α、IL-6降低(P<0.05);相较于Sal-8μmol/L组，Sal+GW0742组上清中IL-10降低，TNF-α、IL-6升高(P<0.05)。见表5。

图2各组凋亡情况比较

表4各组细胞凋亡率比较

表5各组细胞上清中IL-10、TNF-α、IL-6比较

2.5 Sal对CCL2、CCR2mRNA的影响

相较于对照组，IL-1β组CCL2、CCR2mRNA升高(P<0.05);相较于IL-1β组，Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组CCL2、CCR2mRNA降低(P<0.05);相较于Sal-8μmol/L组，Sal+GW0742组CCL2、CCR2mRNA升高(P<0.05)。见表6。

2.6 Sal对增殖、凋亡及CCL2-CCR2信号轴蛋白表达的影响

相较于对照组，IL-1β组Cleaved Caspase-3、CCL2、CCR2表达升高，PCNA表达降低(P<0.05);相较于IL-1β组，Sal-2μmol/L、Sal-4μmol/L、Sal-8μmol/L组Cleaved Caspase-3、CCL2、CCR2表达降低，PCNA表达升高(P<0.05);相较于Sal-8μmol/L组，Sal+GW0742组Cleaved Caspase-3、CCL2、CCR2表达升高，PCNA表达降低(P<0.05)。见图3和表7。

表6各组细胞中CCL2、CCR2 mRNA比较

图3各组细胞中PCNA、Cleaved Caspase-3、CCL2、CCR2蛋白表达比较

3、讨论

以关节软骨退化为特征的OA是世界范围内常见的关节疾病，被认为是一个世界性的公共卫生问题[12]。OA的病理变化涉及软骨损伤、细胞外基质降解、滑膜炎、软骨下骨重塑和骨赘形成。细胞因子IL-1β是炎症反应的关键介质，炎症反应会诱导关节软骨细胞过度凋亡，加剧慢性疾病和急性组织损伤期间的损伤[13]。本研究用IL-1β诱导软骨细胞炎性损伤模型发现，软骨细胞集落形成数、抗炎因子IL-10、增殖蛋白PCNA表达均降低，细胞凋亡率、促炎因子TNF-α、IL-6水平升高。提示，经IL-1β诱导后可抑制软骨细胞活性，促进细胞凋亡及炎症反应发生。

表7各组细胞中增殖、凋亡及CCL2-CCR2信号轴蛋白表达比较

IL-1β通过诱导炎性细胞因子产生、细胞外基质丢失和软骨细胞凋亡来加速OA的进展。既往研究报道，细胞凋亡在软骨细胞病理过程中起关键作用，抑制软骨细胞凋亡是预防OA的潜在治疗靶点[14-15]。研究发现，Sal对OA具有保护作用，可以促进成骨细胞的增殖和分化，抑制破骨细胞诱导的骨质流失[5]。Sal通过抑制PI3K/Akt信号转导，抑制炎症反应，从而减弱IL-1β诱导软骨细胞凋亡[16]。软骨细胞过度凋亡破坏细胞增殖和凋亡的动态平衡，软骨细胞和软骨基质崩解明显减少，这是OA的主要病理。细胞凋亡的核心事件是半胱氨酸蛋白酶家族的激活，导致细胞破坏。pro-caspase-3是Caspase-3的一种关键前体，可以切割死亡底物，最终导致细胞凋亡。沉默Caspase-3基因的可抑制软骨细胞凋亡并延缓手术诱导的骨关节炎的进展[17]。本研究发现，Sal可升高抗炎因子IL-10水平，促进了软骨细胞的增殖，降低凋亡率及炎性因子TNF-α、IL-6水平并抑制了凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表达。提示Sal可增强关节软骨细胞活性，抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡和炎症反应。

趋化因子CCL2(又名MCP-1)及其受体CCR2在OA患者和OA啮齿动物模型中均显著增加，CCL2-CCR2信号轴并已被证明可介导人类和啮齿动物的OA疼痛[18-20]。关节软骨细胞中CCL2-CCR2轴的触发可激活特定MAPK通路，导致软骨降解酶的基因表达[21]。阻断CCL2-CCR2信号轴，可降低关节炎症，促进软骨细胞增殖、抑制其凋亡、减轻软骨损伤[22]。本研究发现，IL-1β诱导的关节软骨细CCL2、CCR2mRNA及蛋白升高，Sal组CCL2、CCR2 mRNA及蛋白表达降低，表明Sal可以抑制CCL2-CCR2信号轴蛋白的表达。而8μmol/L Sal与CCL2-CCR2信号通路激活剂GW0742联合干预后，关节软骨细胞活性减弱，炎性因子水平及细胞凋亡增加，表明GW0742可减弱Sal对IL-1β诱导的关节软骨细胞炎性损伤的保护作用。提示Sal可能通过抑制CCL2-CCR2通路，减轻IL-1β诱导的关节软骨细胞炎性损伤。

综上，Sal可能通过抑制CCL2-CCR2通路，增强关节软骨细胞活性，从而抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡和炎症反应。

参考文献:

[10]李浩,戎帅,刘连涛,等.鸦胆子苦醇通过CC趋化因子配体2-C-C趋化因子受体2信号通路对骨肉瘤细胞增殖､凋亡和免疫逃逸的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2023,31(12):1-6,14.

[11]张安琪,郑福增,周子朋,等.女贞子多糖对IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤和炎症反应的作用[J].中成药,2022,44(5):1447-1453.

[15]王西彬,左瑞庭,王新立,等.钩藤碱通过Nrf2/HO-1信号通路抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(7):966-970,986.

文章来源:张学登,先明博,王红辉.红景天苷对关节软骨细胞炎性损伤的影响[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(12):1781-1786.