膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一种慢性退行性关节疾患，严重影响患者的劳动能力及生活质量；流行病学调查显示，我国40岁以上人群膝骨关节炎发病率高达46.3%[1]。临床上西医针对膝骨关节炎主要采用抗炎镇痛或改善病情的药物、软骨移植修复术、关节置换术等治疗手段，同时存在药物毒副作用明显、治疗成本较为高昂、手术易致后遗症等缺陷。中医药凭借其辨证施治、不易耐药等自身优势，在膝骨关节炎等慢性病的防治领域发挥重要作用[2]。据报道阳虚寒凝型是膝骨关节炎人群中较为多发的证型[3],膝舒方以“补肝肾亏虚、调气血失和、祛寒湿瘀痹”为治则组方，临床应用多年，疗效确切[4]。本研究通过建立阳虚寒凝型膝骨关节炎实验兔模型，从分子水平及基因水平探讨膝舒方的作用环节和作用机制，以期为其临床应用及深入研发提供参考，现报告如下。

1、材料和方法

1.1实验动物

健康清洁级新西兰兔，雌雄各半，体重为(2.2±0.2)kg,由郑州市兔尔康牧业有限公司提供，许可证号为SCXK(豫)2021-0001;置于标准动物房分笼饲养，自由摄食、饮水。实验动物相关操作严格遵循河南中医药大学动物伦理规定。

1.2药物和试剂

膝舒方(组方：狗脊20 g,熟地20 g,当归15 g,党参15 g,杜仲12 g,淫羊藿12 g,土元10 g,制鳖甲15 g,独活12 g,威灵仙12 g,川牛膝20 g)饮片由河南中医药大学第二附属医院中药房提供，并制成生药含量1.6 g/mL的水煎液。塞来昔布胶囊(商品名为西乐葆，规格为200 mg/粒),美国辉瑞制药有限公司。木瓜蛋白酶，美国Sigma-Aldrich公司。薄荷油(纯度99%),上海易恩化学技术有限公司。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-4、IL-6、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，美国R&D Systems公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒及RT-qPCR试剂盒，美国Applied Biosystems公司。引物：基质金属蛋白酶1(Matrix Metalloproteinase-1,MMP-1)、MMP-3、组织金属蛋白酶抑制因子1(Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases-1,TIMP-1)及内参GAPDH由上海生工生物工程股份公司提供。

1.3仪器设备

微量移液器，德国Eppendorf公司。Forma 702型超低温冰箱，美国Thermo Fisher Scientific公司。CSI-TE014-5000型人工气候箱，上海诚卫仪器科技(德国)有限公司。Universal 320R型高速冷冻离心机，德国Hettich公司。BX41型光学显微镜，日本Olympus公司。DNM-9602G型酶联免疫检测仪，美国Bio-Rad公司。Mx3000P型实时荧光定量PCR仪，美国Agilent公司。

1.4方法

1.4.1阳虚寒凝型膝骨关节炎模型的建立

采用木瓜蛋白酶、薄荷油联合气候箱的方法[5]造模。简言之，实验兔的右膝关节提前备皮，麻醉后仰位固定，膝关节消毒，于髌韧带上方进针，向关节腔内注入4%木瓜蛋白酶溶液0.3 mL,注射后再次消毒，屈伸数次膝关节使木瓜蛋白酶在关节腔内充分浸润；每隔3 d注射1次，共注射3次。自第1周开始，每日将实验兔置于温度4℃、湿度50%的人工气候箱内，每次时长2 h,持续5周。自第3周开始，实验兔每日予以0.65 mL/kg薄荷油灌胃1次，连续3周。5周后对实验兔进行奎森膝关节功能演算指数(Lequesne Algofunctional Index)[6]评分，评估造模情况；并随机选取2只实验兔处死，打开右膝关节腔，可见关节软骨变薄、色泽暗淡、表面粗糙或有裂隙，滑膜组织明显充血，则可确定模型建立成功。

1.4.2分组和干预

将模型兔分为4组(每组12只):模型组(等体积溶液),阳性组(塞来昔布100 mg/kg)[7],膝舒方高、低剂量组(按人体表面积换算成兔等效剂量，生药量分别为16和8 g/kg)。另取未造模的正常新西兰兔12只，作为空白组(等体积溶液)。各组灌胃给药1次/d,持续6周。

1.4.3观察指标

1.4.3.1膝关节功能：

各组实验兔分别于给药前、给药3周后、给药6周后评价Lequesne指数，从疼痛、肿胀、步态及关节活动范围等方面评估实验兔的膝关节功能。由两名研究者根据评分标准[6]独立进行评价，评分越高膝关节功能越差。

1.4.3.2中医证候评分：

各组实验兔分别于给药前、给药3周后、给药6周后根据中医基础理论评价实验动物的证候，同时参照《辨证论治实验方法学》[8]对实验兔的阳虚证(体重降低、心率减慢、倦怠嗜卧、唇/爪/尾/耳色淡、小便色淡、毛发无/少光泽等)及寒凝证(体温降低、呼吸减弱、精神萎靡、反应迟钝、蜷缩发抖、爪/尾凉等)进行评分。评价由两名研究者独立进行，评分越高症状越重。

1.4.3.3膝关节软骨组织病理变化：

末次给药后，各组实验兔禁食不禁水12 h,采用空气栓塞法处死，解剖右膝关节，取软骨组织，经4%多聚甲醛固定后制备切片，行HE染色，光镜下观察关节软骨的组织形态学病理变化。由两名病理分析师按照改良Mankin's评分法[9]对切片进行评分，分数越高表示关节软骨损伤越严重。

1.4.3.4血清细胞因子表达：

实验兔处死后自腹主动脉采血，静置20 min, 4℃离心分离出血清。双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)具体操作按试剂盒说明书进行，血清样品用酶联免疫检测仪测定450 nm下吸光度(OD)值，并根据标准曲线计算血清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6及抗炎细胞因子IL-4、IL-10浓度。

1.4.3.5关节软骨MMP-1、MMP-3、TIMP-1基因表达：

实验兔处死后，解剖右膝关节，取股骨内侧髁负重区，置于液氮中冻存。于液氮环境下剥离股骨内侧髁负重区的关节软骨并研磨，实时荧光定量PCR具体操作按试剂盒说明书进行，Trizol试剂法提取总RNA,经逆转录反应获得cDNA,按说明书设置反应参数，通过MMP-1、MMP-3、TIMP-1引物行RT-qPCR反应，分析获得样本基因Ct值后，以GAPDH为内参基因，应用公式2-ΔΔCt计算样本基因的相对表达水平。引物序列如下：MMP-1,上游5′-TCAGTTCGTCCTCAC- TCCAG-3′,下游5′-TTGGTCCACCTGTCATCTTC-3′;MMP-3,上游5′-GCCAAGAGATGCTGTTGATG′,下游5′-AGGTCTGTGAAGGCGTTGTA-3′;TIMP-1,上游5′-GCAACTCCGACCTTGTCATC-3′,下游5′-AG- CGTAGGTCTTGGTGAAGC-3′;GAPDH,上游5′-TC- ACCATCTTCCAGGAGCGA-3′,下游5′-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3′。

1.5统计学方法

数据导入SPSS 22.0软件进行处理，多组间采用单因素方差分析，两两比较方差齐者采用SNK检验，方差不齐者采用Dunnett检验；同一指标的不同时段采用重复测量方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔膝关节功能的影响

空白组表现正常，膝关节功能未受影响。自造模后至给药6周后，模型组实验兔膝关节肿胀和压痛明显，骨性标记变浅，膝关节活动范围变小，明显跛行；Lequesne指数维持较高的数值，与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。膝舒方高、低剂量组及阳性组(塞来昔布组)实验兔患肢肿胀和压痛反应显著减轻，骨性标记、膝关节活动范围及跛行现象均有所改善；给药3周后或6周后，Lequesne指数与同时段模型组相比均有显著降低，组间差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表1。

表1膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔Lequesne指数的影响(n=12,x¯±s)

2.2膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔中医证候的影响

空白组个别实验兔偶发症状，与其机体状态有关，非骨关节炎引发。与空白组比较，模型组实验兔自造模后至给药6周后均出现阳虚寒凝症状，中医证候评分均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。膝舒方高、低剂量组及阳性组给药3周后或6周后的中医证候评分与同时段模型组相比均有显著降低，组间差异均有统计学意义(P<0.01);给药6周后，膝舒方高、低剂量组的中医证候评分与阳性组比较有显著降低，差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔中医证候评分的影响(n=12,x¯±s)

2.3膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔关节软骨形态学的影响

空白组组织结构正常，软骨细胞排列整齐，潮线清晰。模型组软骨退变明显，组织结构受损，基质染色不均匀，软骨细胞排列紊乱，潮线破坏严重。膝舒方高、低剂量组及阳性组的关节软骨在结构完整性、细胞排列、基质、潮线等方面均有不同程度的改善，见图1。与空白组比较，模型组关节软骨改良Mankin's评分显著增高，差异有统计学意义(P<0.01);膝舒方高、低剂量组可明显降低改良Mankin's评分，与模型组比较组间差异有统计学意义(P<0.01),见表3。

2.4膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔血清细胞因子的影响

图1各组关节软骨形态学代表性图片(HE,×100)  

表3膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔关节软骨 改良Mankin's评分的影响(n=12,x¯±s)

与空白组相比，模型组实验兔血清促炎细胞因子IL-1β、IL-6及抗炎细胞因子IL-4、IL-10水平均有明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。给药6周后，与模型组相比，膝舒方高、低剂量组IL-1β、IL-6水平均有显著降低，差异有统计学意义(P<0.01);IL-4和IL-10水平均有显著增高，差异有统计学意义(P<0.01)。阳性组血清IL-1β和IL-6表达较模型组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01);IL-4和IL-10表达与模型组相比差异无统计学意义，见表4。

表4膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔血清促炎/抗炎细胞因子的影响(n=12,x¯±s)

2.5膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔MMP-1、MMP-3和TIMP-1基因表达的影响

与空白组相比，模型组实验兔关节软骨MMP-1、MMP-3和TIMP-1 mRNA相对表达量均有明显上调(P<0.01)。给药6周后，膝舒方高、低剂量及塞来昔布可使MMP-1、MMP-3 mRNA相对表达量显著下调，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01),对TIMP-1 mRNA相对表达量则无明显影响，见表5。

表5膝舒方对阳虚寒凝型膝骨关节炎兔关节软骨MMP-1、MMP-3和TIMP-1 mRNA相对表达量的影响(n=12,x¯±s)

3、讨论

膝骨关节炎属中医学“骨痹”“历节病”等范畴，多因外邪凝滞于络，经脉痹阻不通，致膝关节及周围肌肉出现肿胀、疼痛、僵硬、屈伸不利等症状；阳虚寒凝型患者则因阳气不足，自体虚弱，外感风寒湿邪，同时伴有神疲倦怠、不欲饮食、形寒肢冷、苔白舌淡等症状[10]。本研究采用关节腔注射木瓜蛋白酶的方式建立膝骨关节炎兔模型，实验兔的关节腔可见炎症反应、滑膜充血等现象，关节切片形态学观察可见软骨受损明显，结合反映膝关节功能的Lequesne指数，提示模型建立成功；采用寒凉之品薄荷油灌胃联合气候箱营造湿冷环境的方式诱导实验兔的阳虚寒凝证[5,11],根据实验兔整体表现及中医证候积分，其基本符合阳虚寒凝的证候特征，能够一定程度上模拟疾病状态。

阳虚寒凝型膝骨关节炎主要内因为肝肾亏虚、气血失和，主要外因为外感风寒湿邪、筋脉痹阻不通。膝舒方用狗脊、熟地为君，补肝肾，强筋骨；当归、党参为臣，以补益气血，助君益气；一佐杜仲、淫羊藿温阳散寒，祛风除湿；二佐土元、鳖甲活血通络，软坚散结；三佐独活、威灵仙祛寒除湿，通络镇痛；川牛膝逐瘀通络，引药下行为使；诸药合用，共奏“补肝肾亏虚、调气血失和、祛寒湿瘀痹”之功。临床研究表明，膝舒方口服可显著降低膝骨关节炎膝关节疼痛视觉模拟量表(VAS)评分及Lequesne指数评分，改善患者的临床症状体征[12]。

免疫炎症过程与膝骨关节炎病理进展及关节软骨的退行性改变密切相关，促炎/抗炎细胞因子在该过程中发挥举足轻重的作用。IL-1β和IL-6作为主要的炎症介质，参与膝骨关节炎发生发展的整个过程，不仅介导关节腔的炎症级联反应，还可刺激多种蛋白酶的激活，影响软骨细胞的合成/凋亡，导致关节软骨破坏[13];有研究指出膝骨关节炎患者关节液和血清中IL-1β、IL-6水平与其病程发展正相关，可作为判断病情的生物标志物[14]。抗炎细胞因子IL-4和IL-10一方面增强机体天然免疫力，经负反馈效应抑制促炎因子的过度释放，另一方面可保护软骨和维持关节结构的完整性，有利于软骨细胞的修复[15];据报道将IL-4和IL-10融合蛋白应用于膝骨关节炎动物模型，能减轻机体的疼痛症状，改善膝关节功能，说明抗炎细胞因子疗法具有潜在的临床应用价值[16,17]。本研究中模型组膝骨关节炎兔血清促炎细胞因子IL-1β、IL-6及抗炎细胞因子IL-4、IL-10水平比空白组正常兔均有明显增高，说明这些细胞因子与阳虚寒凝型膝骨关节炎的病变进程存在相关性；给药6周后，膝舒方各剂量组IL-1β和IL-6水平均有显著降低，IL-4和IL-10水平均有显著增高，提示膝舒方可能是通过纠正促炎/抗炎细胞因子间的失衡，改善关节腔内炎症反应，维持关节微环境稳态，进而减轻软骨的退变，促进骨组织的修复；塞来昔布对血清IL-4和IL-10表达无显著影响，提示其抗膝骨关节炎作用环节与膝舒方有所不同。

关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成，正常情况下细胞外基质的合成与降解处于平衡状态；当膝骨关节炎发生时，软骨细胞过量分泌基质金属蛋白酶(MMPs),打破了基质金属蛋白酶与组织金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)之间的动态平衡，从而引发细胞外基质的过度降解，促使软骨细胞过度凋亡，直接或间接造成软骨的破坏和缺损[18]。其中MMP-1对细胞外基质最具特征、含量最多的Ⅱ型胶原的降解起主导作用，MMP-3参与降解细胞外基质、基质膜成分及骨有机质，还能激活其他基质金属蛋白酶相关因子，引起级联效应；多项研究[19,20]均表明，MMP-1和MMP-3在膝骨关节炎患者的关节软骨组织及滑膜液中表达明显增高，其持续表达贯穿病程始终，抑制因子TIMP-1水平变化虽与MMP-1和MMP-3的表达正相关，但基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制因子总体上呈现失衡状态。叶超等[21]研究指出，基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制因子-1等不仅可作为膝骨关节炎诊断、病情严重程度及疗效评估的指标，还与膝骨关节炎中医辨证分型有一定相关性。本研究结果显示，阳虚寒凝型膝骨关节炎模型兔关节软骨中MMP-1、MMP-3和TIMP-1 mRNA相对表达量均有明显上调，说明模型兔的关节软骨组织处于过度降解状态，这与上述文献报道的结论类似；给药6周后，膝舒方高、低剂量可显著下调MMP-1及MMP-3 mRNA相对表达量，对TIMP-1 mRNA相对表达量则无明显影响，结合关节软骨形态学病理研究结果，提示膝舒方的作用环节之一是通过调控MMP-1和MMP-3释放，纠正基质金属蛋白酶/组织金属蛋白酶抑制因子的失衡状态，抑制关节基质降解，延缓软骨退变。

综上所述，膝舒方一定程度上可减轻阳虚寒凝型膝骨关节炎兔关节组织的炎症反应，维持软骨细胞赖以生存的微环境，并可纠正关节基质代谢紊乱，促进软骨修复，改善膝关节功能及软骨损伤。鉴于膝骨关节炎病理进程涉及因素的复杂性及相关因子的关联性，膝舒方是通过何种信号通路干预膝骨关节炎，有待进一步研究。

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基金资助:河南省高校科技创新人才支持计划(15HASTIT041);

文章来源:葛炎,田松云,刘鑫鑫,等.膝舒方防治阳虚寒凝型膝骨关节炎的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志,2024,32(07):18-23.