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甘露糖抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和诱导凋亡的影响

2024-03-29 8 上传者：管理员

摘要：目的研究甘露糖抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和诱导凋亡及其对Wnt/β-catenin通路的影响。方法体外培养宫颈癌HeLa细胞，分为对照组(未经任何处理)和低、中、高剂量实验组(用甘露糖浓度为5、10、25 mmol·L-1处理细胞)。以细胞计数试剂盒8(CCK-8)和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况，以蛋白质印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、p21、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达。结果对照组和低、中、高剂量实验组的细胞抑制率分别为(0.00±0.13)%、(11.25±3.42)%、(23.78±3.41)%和(35.98±4.52)%,凋亡率分别为(4.59±0.35)%、(11.45±1.32)%、(18.47±2.01)%和(25.69±2.43)%, p21蛋白相对表达水平分别为0.21±0.03、 0.34±0.04、 0.51±0.06和0.69±0.05, Bcl-2蛋白相对表达水平分别为0.89±0.06、 0.67±0.04、 0.52±0.05和0.35±0.06, Bax蛋白相对表达水平分别为0.34±0.05、 0.49±0.06、 0.65±0.07和0.81±0.06, Wnt1蛋白相对表达水平分别为0.74±0.07、 0.60±0.05、 0.46±0.05和0.32±0.04, β-catenin蛋白表达分别为0.80±0.06、 0.65±0.05、 0.47±0.06和0.29±0.05。上述指标，对照组与低、中、高剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论甘露糖抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和诱导凋亡，作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路有关。

关键词：
Wnt/β-catenin通路
凋亡
增殖
宫颈癌
甘露糖
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我国是宫颈癌高负担国家之一，在女性癌症中发病率位居第2,占全球新发病例1/3,近年发病率呈年轻化趋势发展，严重威胁女性生命安全[1]。报道显示，宫颈癌与高危型人乳头状瘤病毒持续感染有关，手术、放化疗、分子靶向等是治疗宫颈癌有效手段，可延长患者生存期限，但患者易复发、转移，影响预后[2]。甘露糖属蛋白质糖基化单糖，与糖蛋白、免疫调节密切相关，近年随着对甘露糖糖代谢途径、生物学效应研究的深入，发现甘露糖具有抗肿瘤、抗菌、调节免疫、治疗肥胖等药理作用[3]。研究显示，甘露糖可抑制体内、体外结直肠癌发生，并抑制结直肠癌细胞增殖[4]。Wnt/β-catenin通路在宫颈癌中发挥重要作用，可介导参与宫颈癌发展。本研究主要探究甘露糖抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和诱导凋亡及其对Wnt/β-catenin通路的影响。

一、材料与方法

1 材料

细胞宫颈癌HeLa细胞，购自上海细胞库。

药品与试剂D-甘露糖：纯度：≥99%,规格：每支10 g, 批号：20210812,购自美国Sigma Aldrich公司。胎牛血清、杜氏改良依格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM)培养基，均购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒，购自上海碧云天公司；凋亡试剂盒，购自艾美捷科技有限公司；B淋巴细胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体、p21抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗体、Wnt1抗体、β-catenin抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体，均购自英国Abcam公司。

仪器ELX800酶标仪，美国Bio-Tek仪器公司产品；Accuri C6流式细胞仪，美国BD Biosciences公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养

宫颈癌HeLa细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基中，置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中。每天观察细胞生长情况，贴壁生长至85%加胰酶消化培养。

2.2 细胞分组与处理

将HeLa细胞分为对照组和低、中、高剂量实验组。对照组未经任何处理，空白培养；低、中、高剂量实验组分别用5、10、25 mmol·L-1的甘露糖处理。最后以25 mmol·L-1甘露糖进行实验，记作甘露糖组，将25 mmol·L-1甘露糖和20 μmol·L-1 Wnt信号通路抑制药FH-535处理细胞，记作甘露糖+FH-535组。

2.3 CCK-8检测细胞增殖情况[5]5]

取各组HeLa细胞接种96孔板中培养24 h, 每孔加CCK-8溶液10 μL,恒温下孵育1 h, 用酶标仪在450 nm检测光密度值，用于计算细胞抑制率。细胞抑制率=1-(实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况[6]6]

取各组HeLa细胞培养24 h后，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，将细胞用结合缓冲液悬浮培养，加膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶各5 μL,室温下孵育15～20 min, 上流式细胞仪检测。

2.5 蛋白质印迹法检测Bcl-2、p21、Bax、Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达水平[7]7]

取各组HeLa细胞培养24 h后，提取细胞中蛋白，蛋白经检测浓度、变性后，用12%凝胶电泳处理上样蛋白，转膜后放入5%脱脂奶粉中封闭培养1 h, 室温下加一抗蛋白Bcl-2、p21、Bax、Wnt1、β-catenin及内参GAPDH过夜孵育，次日加二抗孵育1 h, 滴加化学发光试剂显色、曝光，以GAPDH作为内参，Image J软件分析蛋白灰度值。

3 统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料用表示，多组间比较用单因素方差分析，组内比较用LSD-t检验。

二、结果

1 不同浓度甘露糖对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响

对照组未经任何处理，空白培养；低、中、高剂量实验组分别用5、10、25 mmol·L-1的甘露糖处理。

与对照组相比，低、中、高剂量实验组细胞抑制率、凋亡率均明显升高(均P<0.05),见图1和表1。

2 不同浓度甘露糖对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响

与对照组相比，低、中、高剂量实验组p21、Bax蛋白相对表达水平明显升高，Bcl-2蛋白相对表达水平明显降低(均P<0.05),见表2和图2。

图1 4组细胞凋亡率

表1 甘露糖抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和诱导凋亡

3 不同浓度甘露糖对宫颈癌HeLa细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白的影响

与对照组相比，低、中、高剂量实验组Wnt1、β-catenin蛋白相对表达水平均明显降低(均P<0.05),见图3和表3。

4 Wnt/β-catenin通路抑制剂和甘露糖对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响

甘露糖组和甘露糖+FH-535组细胞的抑制率分别为(36.73±4.75)%和(50.11±5.49)%,凋亡率分别为(25.44±2.17)%和(31.43±2.87)%。与甘露糖组相比，甘露糖+FH-535组细胞抑制率、凋亡率均明显升高(均P<0.05),见图4。

图2 4组细胞p21、Bax、Bcl-2蛋白的表达情况

表2 甘露糖对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响

图3 细胞Wnt1和β-catenin蛋白的表达

表3 甘露糖对宫颈癌HeLa细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白的影响

5 Wnt/β-catenin通路抑制剂和甘露糖对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响

甘露醇组和甘露糖+FH-535组的p21蛋白相对表达水平分别为0.68±0.06和0.82±0.05,Bcl-2蛋白相对表达水平分别为0.37±0.04和0.21±0.03,Bax蛋白相对表达水平分别为0.79±0.07和0.95±0.06。与甘露糖组相比，甘露糖+FH-535组p21、Bax蛋白相对表达水平均明显升高，Bcl-2蛋白相对表达水平明显降低(均P<0.05)。

图4 2组细胞凋亡率结果

三、讨论

宫颈癌早期症状表现为接触性出血，中晚期表现为不规则阴道流血，还可出现尿频、便秘及下肢肿痛等，在世界范围内，每年约有53万新发病例[8]。目前临床针对宫颈癌治疗多为放化疗、外科手术及分子靶向治疗等，但由于宫颈癌发病机制复杂，发病率、致死率高特点，还易复发、转移，在很大程度上降低了宫颈癌患者的生存期[9]。

甘露糖是一种低效的细胞能量来源，不仅参与糖蛋白合成和免疫调节，还可通过调节细胞增殖、迁移、凋亡等生物学过程参与机体抗肿瘤过程[10]。在糖代谢过程中，甘露糖在己糖激酶作用下转化为甘露糖-6-磷酸，且与葡萄糖有相同转运体，其受体还可在巨噬细胞、树突状细胞广泛表达，并进一步细胞摄取和呈递抗原[11,12]。正常细胞中90%能量与线粒体氧化、磷酸化有关，但肿瘤细胞具有高乳酸、高糖吸收等特点[13],目前有关糖代谢为治疗靶点的研究受到关注，近年随着对甘露糖生物学效应研究深入，发现甘露糖可通过干扰葡萄糖代谢、抑制增殖等方面发挥抗肿瘤作用[14]。本研究采用不同浓度甘露糖处理宫颈癌细胞，发现细胞抑制率、凋亡率明显增高，p21、Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，表示甘露糖可抑制宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡。

Wnt/β-catenin通路是一种研究较为广泛的信号转导途径，该通路通过调节共激活因子β-catenin活化，进而调控下游基因表达从而发挥细胞生长发育、分化、凋亡、迁移等诸多环节[15]。若该信号通路中未存在Wnt配体时，位于细胞质中β-catenin可与轴蛋白、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)及酪蛋白激酶1等形成复杂的复合物，被GSK3磷酸化，后磷酸化β-catenin最终可被识别、泛素化后，被蛋白酶降解[16]。研究显示，Wnt/β-catenin通路异常激活与妇科肿瘤发生发展密切相关，包括在内宫颈癌[17],如夏娜娜等[18]研究显示，安罗替尼可通过抑制Wnt/β-catenin通路激活从而发挥宫颈癌抗肿瘤作用，可有效抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。还有研究显示，茯苓酸可抑制宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，其对宫颈癌抗肿瘤作用可能与抑制Wnt通路活性有关[19]。本研究发现，甘露糖呈剂量依赖性抑制Wnt1、β-catenin蛋白表达，表明甘露糖对宫颈癌细胞抗肿瘤作用，可能与甘露糖Wnt/β-catenin通路有关。加入Wnt通路抑制剂后，发现细胞抑制率、凋亡率明显升高，p21、Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，提示甘露糖可通过调节Wnt/β-catenin通路参与宫颈癌恶性进展。

参考文献:

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[4]王浩,李海涛.甘露糖通过下调GLUT1抑制结直肠癌发生及增殖[J].食品与发酵工业,2020,46(10):53-59.

[5]万珊珊,梁军,孙晓冬,等.甘草查尔酮A对人脑胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响及机制研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(13):1875-1878.

[6]任静宇,范玲玲,段冷昕,等.常春藤皂苷通过活性氧-p38/JNK通路调控食管鳞癌细胞迁移和凋亡的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(8):1147-1151.

[7]杨乾舸,覃禹铭,李武志.左布比卡因对子宫内膜癌细胞RL-952生长和线粒体膜电位的影响[J].中国临床药理学杂志,2023,39(12):1723-1727.

[9]刘梦甜,史琳.宫颈癌常规筛查手段及检测指标的研究进展[J].中国计划生育学杂志,2023,31(7):1746-1750.

[11]许慧,申采奕,秦子健,等.甘露糖的临床应用研究进展[J].实用临床医药杂志,2021,25(14):103-107.

[18]夏娜娜,杨京蕊,戴劲,等.安罗替尼对宫颈癌细胞增殖和迁移与侵袭的影响及作用机制[J].热带医学杂志,2023,23(2):137-142,148,132.

[19]申利,翁丹卉.茯苓酸抑制TRIM29表达通过Wnt信号通路调控宫颈癌细胞存活和凋亡[J].广州中医药大学学报,2020,37(1):140-146.

基金资助:四川省科学技术厅2022年第二批省级科技计划､科技服务业､农业科技成果转化基金资助项目(2022NSFSC0776);

文章来源:叶礼翠,王静依,向睿,等.甘露糖抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和诱导凋亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(06):834-838.