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基于PI3K/AKT信号通路研究槲皮素对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

2024-04-27 33 上传者：管理员

摘要：目的基于磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路研究槲皮素对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响。方法以宫颈癌(HeLa)细胞为研究对象，给予不同浓度槲皮素进行培养(0、20、40、80μmol/L),分别命名为A、B、C、D组。MTT法检测HeLa增殖活力；观察HeLa细胞凋亡率；对比HeLa细胞凋亡形态；分析HeLa细胞周期改变；检测HeLa细胞PI3K/AKT蛋白表达。结果随槲皮素浓度攀升，HeLa细胞增殖活力减弱，凋亡率增高，G0/G1期细胞比例降低，S期比例增加，PI3K、AKT蛋白表达下降，各组两两比较差异显著(P<0.05)。A组细胞形状较为规整，大小均匀，染色后呈现绿色圆形；槲皮素作用后，其形态与颜色出现改变，B组出现少量核固缩，C组细胞形态各异，出现染色质浓缩，核固缩，细胞呈新月形等，D组细胞形态发生明显的变化，凋亡细胞明显增多，染色质浓缩，细胞核碎裂呈点状或分叶状，细胞膜完整和膜泡状突起等典型的凋亡形态细胞。结论槲皮素能够降低宫颈癌细胞的增殖活力，并诱导其凋亡，这可能是通过槲皮素抑制PI3K/AKT信号通路及相关蛋白表达来实现的。

关键词：
凋亡
增殖
宫颈癌
槲皮素
磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)
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宫颈癌是较为常见的生殖器官癌症[1],临床常伴有阴道出血、分泌物增加等症状，严重影响患者的生理及心理健康，也给患者及其家庭带来较大的经济负担。现阶段的研究表明，宫颈癌的发病率和死亡率呈日益渐长趋势[2,3]。目前，临床治疗宫颈癌的方式以手术为主，并辅助以放疗、化疗，虽然对这种治疗方式对宫颈癌患者起到了一定的效果，但也存在一些局限性，手术切除后，部分患者可能出现病情复发，无法彻底治愈，远期生存率较低等问题，而放化疗则会出现复副作用大，患者不耐受及耐药性等问题[4,5,6,7]。近年来，随着中药治疗肿瘤的发展，越来越多的学者将宫颈癌治疗的研究方向转移至中草药[8]。槲皮素是临床常见的应用于癌症治疗的药物，也被研究证实具有抵抗炎症、病毒、增强免疫、保护心血管、减缓氧化等临床疗效[9,10,11]。也有报道说其具有抑制宫颈癌发展的作用[12],但作用机制尚不完全明确。本研究通过实验探索槲皮素对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响，并对其作用机制进行分析。

1、资料与方法

1.1 细胞、试剂、仪器

宫颈癌HeLa细胞(上海拜力);槲皮素(上海金穗);RPMI1640培养液(北京百奥莱博);裂解液(北京索莱宝);四氮唑蓝(MTT)试剂盒(上海碧云天);凋亡染色及检测试剂盒(北京利维宁);兔抗人磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT,美国Cell Signaling Technology);FC-500流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司);转膜仪(美国Bio-Rad);凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad)。

1.2 HeLa细胞增殖活力

取培养好的HeLa细胞，挪至96孔板，分A(对照组)、B(低剂量组，20 μmol/L)、C(中剂量组，40 μmol/L)、D组(高剂量组，80 μmol/L),B、C、D组各添加10 μl槲皮素，后各组加入MTT液，黑暗条件下静置4 h后除培养基，加二甲基亚砜150 μl, 震荡10 min后酶标仪检测波长 450 nm 处吸光度，计算各组细胞增殖活力。

1.3 HeLa细胞凋亡率

将HeLa细胞挪至6孔板，分组，48 h后制单细胞悬液。步骤根据说明进行，用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡。

1.4 HeLa细胞凋亡形态

按常规制备细胞爬片并培养，24 h后按说明书操作，镜下观察并拍照。

1.5 HeLa细胞周期

将HeLa细胞浓度调整至1 × 106个/ml, 重悬，4 ℃过夜固定，离心弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加入500 μl核糖核酸酶(RNase)A/碘化丙啶(PI,50 mg/L),常温黑暗环境下等待30 min后分析。

1.6 HeLa细胞PI3K/AKT蛋白表达

HeLa细胞分组，取总蛋白，电泳后转膜，添加一抗(1∶500)4 ℃过夜，清洗3次后添加二抗(1∶2 000),等待1 h, 显色，显影，图像分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS23.0软件进行F检验、t检验。

2、结果

2.1 HeLa细胞增殖活力

随槲皮素浓度攀升，HeLa细胞增殖活力减弱，各组两两比较差异显著(P<0.05)。见表1。

2.2 HeLa细胞凋亡率

随槲皮素浓度攀升，HeLa细胞凋亡率增加，各组两两比较差异显著(P<0.05)。见表1、图1。

2.3 HeLa细胞周期

随槲皮素浓度攀升，G0/G1期细胞比例降低，S期比例增加，各组两两比较差异显著(P<0.05)。见表1。

2.4 HeLa细胞PI3K/AKT蛋白表达

槲皮素浓度越高，PI3K、AKT蛋白表达下降越明显，各组两两比较差异显著(P<0.05)。见表1、图2。

表1 各组HeLa细胞增殖活力、凋亡率、细胞周期、PI3K/AKT通路相关蛋白表达比较

图1 各组HeLa细胞凋亡率

图2 各组HeLa细胞PI3K/AKT蛋白表达

2.5 HeLa细胞凋亡形态

A组细胞形状较为规整，大小均匀，染色后呈现绿色圆形；槲皮素作用后，其形态与颜色出现改变，B组出现少量核固缩，C组形状各异，伴核固缩，细胞呈新月形等，D组细胞形态发生明显的变化，细胞凋亡变多，细胞核破碎且形状不一，伴膜泡状突起等。见图3。

图3 各组HeLa细胞凋亡形态(Hoechst33258染色，×400)

3、讨论

本实验结果发现，在槲皮素的作用下，HeLa细胞增殖活力明显减弱，伴随着槲皮素作用浓度的上升，相应的宫颈癌细胞的增殖活力也逐渐降低，这一现象证明其存在浓度依赖性，在王慧玲等[13]关于槲皮素与宫颈癌HeLa细胞的研究中也提到这一现象。凋亡是多细胞的程序性死亡，还关系着基因的激活、表达及调控，并且其对内环境的平衡及稳定具有重要意义，一旦凋亡失衡，会引发发多种疾病，如癌症、自身免疫疾病等。本研究结果发现，在槲皮素的作用下，HeLa细胞的凋亡率显著增加，伴随着槲皮素作用浓度的上升，相应的宫颈癌细胞的凋亡率随之增加，这意味着槲皮素抗宫颈癌的作用是通过诱导宫颈癌细胞凋亡来实现的，唐阳芳等[14]关于槲皮素对宫颈癌细胞影响的研究中也指出这一现象。研究中染色实验也表明了HeLa细胞凋亡的形态改变：宫颈癌细胞凋亡数目增多，细胞核破碎且形态各异，细胞膜、染色质等呈现典型的细胞凋亡形态。细胞周期的紊乱也是癌症进行性发展的原因之一[15]。DNA受到强力破坏时，细胞周期阻滞会引起细胞凋亡。因此，调节肿瘤细胞周期，促进肿瘤细胞凋亡可以有效抑制肿瘤细胞生长[16]。本研究观察HeLa细胞周期发现，受槲皮素作用的影响，宫颈癌细胞在S期出现阻滞，进而由S期向G2/M期的进程被阻断，细胞的有丝分裂不能正常进行，引起细胞凋亡。研究表明[17,18],PI3K/AKT信号通路与细胞的生长、繁殖、凋亡等生物学行为关系密切。AKT在PI3K/AKT信号通路占据重要地位，AKT活化后可以作用于下游因子对细胞的增殖、凋亡、细胞周期等生物学行为进行调节控制，并参与癌症的发生与发展[19,20]。本研究结果推测，槲皮素抑制HeLa细胞增殖和促进HeLa细胞凋亡的作用机制可能与槲皮素抑制PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达有关。

综上，槲皮素可以抑制宫颈癌细胞增殖活力并将细胞阻滞在S期，促进其凋亡，这与槲皮素抑制PI3K/AKT信号通路及其相关蛋白表达密切相关。

参考文献:

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