首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 宫颈癌论文 > STAT3信号通路探讨槲皮素对宫颈癌HeLa细胞的体外抗肿瘤机制

STAT3信号通路探讨槲皮素对宫颈癌HeLa细胞的体外抗肿瘤机制

2024-05-11 14 上传者：管理员

摘要：目的基于信号转导子与转录激活子(STAT)3信号通路探讨槲皮素对宫颈癌HeLa细胞的体外抗肿瘤机制。方法取0、20、40、60、80μmol/ml浓度的槲皮素分别分为对照组、A组、B组和C组，以适宜的条件培养人宫颈癌Hela细胞48 h,检测细胞增殖、凋亡、侵袭和细胞中STAT3。结果随着槲皮素浓度的增加细胞增殖率逐渐减小；凋亡率升高、侵袭数减少，STAT3蛋白及磷酸化水平下调，各组两两比较差异显著(P<0.05)。结论槲皮素可能通过调控Janus激酶(JAK)2/STAT3信号通路来抗肿瘤的。

关键词：
Hela细胞
侵袭
信号转导子与转录激活子(STAT)3
凋亡
增殖
槲皮素
加入收藏

宫颈癌是常见恶性肿瘤[1],致死率高[2,3],现有治疗手段预后差[4,5],所以急需研究开发有效治疗宫颈癌的药物[6,7]。槲皮素是广泛存在的天然的黄酮类有机物，近年来因发现槲皮素有很高的抗癌活性被越来越广泛的研究[5,8]。槲皮素具有抗宫颈癌作用，但其作用机制尚不明确[9,10]。本实验以宫颈癌细胞为对象，基于信号转导子与转录激活子(STAT)3信号通路探讨槲皮素对宫颈癌HeLa细胞的体外抗肿瘤机制。

1、材料与方法

1.1 材料

槲皮素(浩天生物工程有限公司)、人宫颈HeLa细胞(武汉大学医学院)、细胞凋亡检测试剂盒(Gibco 公司)、青链霉素、10%胎牛血清(贵州赛兰博科技有限公司)、二甲基亚砜(DMSO,Solarbio公司)、恒温培养箱(上海来宝科技有限公司)。

1.2 细胞培养

复苏人宫颈HeLa细胞，置于含有10%胎牛血清、青霉素、链霉素的培养液中，在37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，2～3 d调换1次培养液，每3～4 d消化传代1次。

1.3 药物处理及分组

将槲皮素以DMSO为溶剂制备成20、40、80 μmol/ml浓度的溶液，保存于-20 ℃条件下。将处于对数生长期的细胞处理后放置在培养条件下培养24 h, 加入各浓度槲皮素处理 48 h, 分别为A、B、C组，不加槲皮素组(0 μmol/L) 设为对照组。

1.4 检测细胞增殖

将细胞接种于96孔板，在参数为37 ℃、5%CO2的温箱培养贴壁后，每组设5个复孔，以培养基设为空白校正组，温箱放置2 d。之后移除孔板中的溶液，遵循噻唑蓝(MTT)说明书指示加入试剂，检测光密度(OD)490 nm吸光度，进行计算。

1.5 检测细胞凋亡

以0.25%胰酶消化细胞，离心5 min, 丢弃上层清液。用4 ℃预冷之后浓度为70%的乙醇固定；置于4 ℃的冰箱中避光染色；使用细胞仪检测细胞凋亡，多次重复实验。

1.6 检测细胞侵袭

同上离心细胞，用无血清培养基稀释细胞，直到浓度为2×105 /ml, 待用。在24孔板中加入培养基，放置其入Transwell小室，接入各组细胞悬液，培养48 h, 0%冰乙醇溶液固定细胞1 h。结晶染色，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后将未迁移的细胞擦净，计侵袭细胞数。

1.7 检测细胞中STAT3/磷酸化(p)-STAT3的表达

用10%胎牛血清(FBS)RPMI1640调整细胞浓度；取细胞悬液加入事先有表位特异的单克隆抗体(McAb, 5～50 μl)的离心管中，灭活正常兔血清于4 ℃ 30 min; 每次加入2～3 ml的洗涤液，进行清洗，清洗3次，离心5 min; 加入适量固定液，制片后在荧光显微镜下观察，加入100～500 μl固定液；荧光显微镜下观察。

1.8 Western印迹检测蛋白水平

选用Janus激酶(JAK)2抑制剂AG490(40 μmol/L)处理Hela细胞，培养24 h后，分为对照组、槲皮素40 μmol/L组、AG490组和槲皮素40 μmol/L+AG490组进行后续实验，收集各组Hela细胞于离心管中，放置放射免疫沉淀(RIPA)裂解液，电动匀浆器进行裂解，蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脱脂奶粉封闭1 h。加入6种抗体，4 ℃孵育过夜。加入二抗，37 ℃孵育1 h, 实验多次重复。

1.9 统计学分析

采用SSPS19.0软件进行独立样本检验、方差分析、LSD-t检验。

2、结果

2.1 槲皮素对Hela细胞增殖的影响

随着槲皮素浓度的增加细胞增殖率逐渐减小，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 槲皮素对Hela细胞凋亡的影响

对照组、A组、B组、C组随着槲皮素浓度上调后凋亡率也上调，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

2.3 槲皮素对Hela细胞侵袭的影响

随着槲皮素浓度的增加细胞侵袭个数逐渐减少，各组两两比较差异显著(P<0.05)。见表1、图2。

表1 各组细胞增殖率、凋亡率、侵袭数比较

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

图2 各组细胞侵袭(结晶紫染色，×200)

2.4 STAT3/p-STAT3 的表达

随着槲皮素浓度的增加，STAT3、p-STAT3水平显著下调，两两比较差异显著(P<0.05)。见表2、图3。

2.5 槲皮素通过STAT3信号通路调控Hela细胞

与对照组比较，槲皮素40 μmol/L组和AG490组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Bcl-2/β-actin显著下调，Bax/β-actin显著上调(P<0.05);与槲皮素40 μmol/L组和AG490组比较，槲皮素40 μmol/L+AG490组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Bcl-2/β-actin显著下调，Bax/β-actin显著上调(P<0.05)。见表3、图4。

表2 各组STAT3、p-STAT3活化

图3 各组STAT3/p-STAT3表达(免疫荧光，×100)

表3 各组JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达水平的比较

图4 槲皮素对STAT3信号通路表达影响

3、讨论

槲皮素抗宫颈癌可能的途径包括：抑制癌症因子表达、影响癌细胞内表达；干扰其信号通路和传导[11]。有越来越多的学者开始研究信号传导与癌症之间的作用机制[12,13]。STAT3细胞信号转导在细胞中有着至关重要的地位，肿瘤与细胞信号转导过度激活存在一定关联性[14]。

许多抗肿瘤药物都是靠影响癌细胞的生长周期从而起到杀伤作用的。恶性肿瘤细胞有着无限增殖的能力。本实验提示，槲皮素可以有效抑制HeLa细胞的增殖，且与浓度呈依赖性，与相关研究[15,16]结果一致；细胞凋亡是细胞的程序性死亡，维持平衡。凋亡有助于保护基因组的完整性，凋亡缺陷可能促进肿瘤的发生。细胞凋亡在抗肿瘤中占着重要地位是肿瘤治疗中的要点，很多抗癌药物通过诱导各自敏感的细胞来实现凋亡[17];细胞的侵袭力与癌细胞的转移发展也密不可分，本文结果显示，槲皮素能够有效抑制人宫颈癌HeLa细胞迁移，促进凋亡，且与浓度呈依赖性。有学者认为，槲皮素与其他的抗肿瘤药物在化疗中共同使用能发挥增敏效果，并且在一定程度上可以降低患者的耐药性[18]。

信号转导与STATS是一类转录因子，STAT3 在肿瘤组织和细胞中其呈高水平激活状态，对肿瘤细胞的增殖和凋亡等过程具有关键的调控作用[19]。宫颈癌的医治过程中，抑制 STAT3 信号通路能够在一定程度上抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡[20,21]。本研究表明了槲皮素对宫颈癌细胞的体外抗肿瘤效果和机制，为临床上治疗宫颈癌和进一步了解槲皮的抗肿瘤机制提供了一些新数据。本文的不足：实验次数较少结果可能存在偏差，可以增加实验次数提高实验的准确性和精确度，为临床提供更准确的数据，还可以探讨槲皮素与放疗药物合用产生的效果和作用机制。

参考文献:

[2]常佳豪,黄夏曼,陈威,等.宫颈癌的研究进展[J].中华妇幼临床医学杂志(电子版),2017;13(4):486-9.

[3]胡流芳,王迎,任汝静,等.Keapl-Nrf2/ARE信号通路的抗氧化应激作用及其调控机制[J].国际药学研究杂志,2016;43(1):146-52.

[6]黎敏,杨武斌,米本中,等.槲皮素抗癌作用机制相关研究报道[J].中药药理与临床,2018;34(2):129-32.

[9]孙佳,赵冬耕,王明艳,等.槲皮素对SMMC-7721肝癌细胞PI3K/AKT信号通路影响的探讨[J].中国实验方剂学杂志,2012;18(18):223-6.

[10]徐文斌,周青峰,朱雪琼.槲皮素抗宫颈癌作用的研究进展[J].中国中西医结合杂志,2019;39(10):1276-9.

[13]陈娇,张蔚,敖良飞,等.槲皮素对宫颈癌 HeLa 细胞 STAT3 的表达及其信号通路的影响[J].中华临床医师杂志,2011;5(19):5656-61.

[15]黄熙理,陈智颖,邱峰.宫颈癌高危因素研究进展[J].福建医药杂志,2015;37(1):125-7.

[17]张欣,董春力,付丽丽,等.槲皮素对宫颈癌细胞 SiHa增殖的影响[J].国际妇产科学杂志,2017;44(3):304-6.

基金资助:河南省科技发展计划项目(182102311190);

文章来源:王春延,张澍,孙丽.基于STAT3信号通路探讨槲皮素对宫颈癌HeLa细胞的体外抗肿瘤机制[J].中国老年学杂志,2024,44(09):2210-2214.