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亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌ftsI耐药基因位点分析

2025-04-23 85 上传者：管理员

摘要：目的分析亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌ftsI耐药基因位点，为亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌的分子流行病学和治疗提供实验室依据。方法对1株亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌分别进行纸片扩散法（K-B法）和E-test法药敏试验，头孢硝噻吩纸片法检测β-内酰胺酶，凝集法检测血清型，用PCR法扩增菌株ftsI基因，分析菌株ftsI基因突变位点，确定氨基酸置换形式。结果K-B法和E-test法药敏试验均显示该菌株对氨苄西林（6 mm/>256μg/ml）、亚胺培南（6 mm/>32μg/ml）、头孢呋辛（6 mm/>32μg/ml）和复方新诺明（6 mm/>32μg/ml）耐药，对氨曲南（26 mm/2μg/ml）、氯霉素（32 mm/2μg/ml）、环丙沙星（30 mm/0.008μg/ml）、头孢曲松（26 mm/0.25μg/ml）、头孢吡肟（26 mm/2μg/ml）、左旋氧氟沙星（32 mm/0.016μg/ml）、美罗培南（24 mm/0.125μg/ml）、利福平（25 mm/0.25μg/ml）、头孢他啶（26 mm/0.25μg/ml）、四环素（29 mm/0.5μg/ml）和头孢噻肟（26 mm/1μg/ml）均敏感；菌株的β-内酰胺酶阳性，血清型为不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）;β-内酰胺酶基因型为TEM-1型，ftsI基因编码区发现16个突变位点，9个位点为本研究新发现，包括P31S、L165S、A239E、V436A、V547I、N569S、A586S、S594T和A595T。结论 ftsI基因突变可能是亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌的耐药机制之一，ftsI基因不同突变位点可能导致对β-内酰胺类抗生素的不同耐药表型。

关键词：
ftsI基因
NTHi
亚胺培南耐药
流感嗜血杆菌
青霉素结合蛋白3
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流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)是一种主要定植在人体鼻咽部的机会性病原菌,是儿童呼吸道感染的主要致病菌[1],根据有无荚膜多糖,分为有荚膜的可分型和无荚膜的不可分型,可分型包括a､b､c､d､e和f血清型;不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilusinfluenzae,NTHi)不和任何一种分型血清产生凝集反应,曾被认为是一种呼吸道定植的非侵入性的细胞外细菌[2],最近报道NTHi是当前儿童临床感染分离株的主要型别[2]｡NTHi可侵入上皮细胞和巨噬细胞,导致肺炎甚至侵袭性感染[2-3]｡随着抗菌药物的广泛应用,流感嗜血杆菌耐药模式逐渐发生转变,少部分菌株已出现对头孢曲松等三代头孢菌素不敏感的现象[4]｡对于感染流感嗜血杆菌的重症患者,碳青霉烯类抗生素是一道重要防线,具有高度敏感性｡值得关注的是,亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌也有报道,其中青霉素结合蛋白3(penicillin-bindingprotein3,PBP3)的编码基因ftsI突变可能是流感嗜血杆菌对亚胺培南耐药的耐药机制｡考虑到既往研究以国外人群为主,且细菌耐药的异质性,本研究对1株亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌的ftsI基因进行全序列测定,并分析ftsI基因突变形式,为耐药机制研究和临床药物选择提供参考｡

1、材料与方法

1.1临床资料患者,女,7岁,主要临床表现为发热､痉挛性咳嗽､咳痰和气促,曾给予口服“鲜竹沥､阿奇霉素､丙卡特罗口服液､孟鲁司特钠咀嚼片”治疗,症状未见明显好转｡肺部CT显示两肺纹理增多､紊乱,双侧肺野胸膜下可见多发片状模糊影｡入院查体:体温37.4℃,脉搏110次/min,呼吸20次/min,血压101/70mmHg｡咽充血,双侧扁桃体I度肿大｡双肺呼吸音粗,左肺可闻及固定中小水泡音及少量喘鸣音｡实验室检查:白细胞11.85×109/L,红细胞3.79×1012/L,血小板363×109/L,C反应蛋白23.26mg/L,血清淀粉样蛋白A166.1mg/L,降钙素原1.31ng/ml｡血沉69mm/h｡甲型流感病毒弱阳性｡其余指标未见明显异常｡依据儿童社区获得性肺炎诊疗规范(2019年版)[5],诊断为社区获得性肺炎,重症｡明确感染病原体后,给予阿奇霉素和头孢曲松抗感染;雾化吸入特布他林､异丙托溴铵和布地奈德等治疗｡9d临床症状缓解,炎症指标恢复正常,出院｡

1.2仪器与试剂血平板､中国蓝和巧克力平板(郑州安图),HTM培养基(温州康泰),VITEKMS质谱(法国梅里埃),药敏试验纸片(温州康泰),头孢硝噻吩纸片(重庆庞通),血清学分型试剂(广州健仑)｡PCR扩增和测序试剂由上海生工提供｡

1.3方法

1.3.1菌株培养和鉴定将患儿支气管肺泡灌洗液标本分别接种于血平板､中国蓝和巧克力平板,置于35℃5%CO2孵育24h｡挑取巧克力平板上菌落进行革兰染色镜检,观察细菌形态｡用微生物质谱鉴定细菌｡

1.3.2体外药敏试验按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100第33版药敏试验标准,使用HTM培养基分别对可疑流感嗜血杆菌菌株进行K-B法和E-test法药敏试验｡质控菌株为流感嗜血杆菌ATCC49247｡抗菌药物包括氨苄西林､氨曲南､氯霉素､环丙沙星､头孢曲松､头孢吡肟､左旋氧氟沙星､美罗培南､利福平､头孢他啶､四环素､头孢噻肟､亚胺培南､头孢呋辛和复方新诺明｡

1.3.3β-内酰胺酶检测采用头孢硝噻吩纸片刮取少量巧克力平板上菌落,10min内观察结果｡纸片变红为β-内酰胺酶阳性,反之为阴性｡

1.3.4血清学分型采用凝集法检测菌株血清型｡

1.3.5分子生物学鉴定(1)引物设计:依据文献[6]设计TEM-1和ROB-1基因引物｡在GenBank数据库下载流感嗜血杆菌基因序列(参考菌株为RdKW20标准菌株AAC22787.1),委托上海生物公司设计3对ftsI基因引物—ftsIF:5’-ATGGTGAAATTTAATTCCTCGC-3’,ftsIR:5’-TTAATTCACTTTTTGATTCTTGTGT-3’;ftsIFC1:5’-GGTGGGTTATACGGATATTGATGG-3’,ftsIRC:5’-AATAGATTGAACATAAGCTGCTCGT-3’,ftsIFC2:5’-CACCAATTAGTGATCCTCGTTATG-3’)｡(2)PCR扩增体系:PCR反应体系25μl,其中DNA模板1μl､上下游引物各1μl､dNTPs1μl､10×缓冲液2.5μl､TaqDNA聚合酶0.2μl,用去离子水补充至25μl｡(3)PCR扩增条件:95℃预变性5min,95℃30s,58℃30s,72℃30s,30个循环,72℃延伸10min｡(4)ftsI基因突变分析:用DNAMAN软件(Version8),将测序结果与流感嗜血杆菌RdKW20标准菌株的ftsI基因比对｡

2、结果

2.1细菌培养和鉴定菌株经培养后,在巧克力平板上可见圆形､透明似露滴样菌落｡革兰染色镜检可见革兰阴性短小杆菌,两端钝圆,呈双球状或短链状排列,疑似流感嗜血杆菌｡经VITEKMS质谱鉴定为流感嗜血杆菌,鉴定率99.0%｡血平板和中国蓝平板上未见菌落生长｡

2.2β-内酰胺酶和血清型检测头孢硝噻吩纸片变红,β-内酰胺酶阳性｡血清型为不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)｡

2.3药敏试验菌株K-B法和E-test法药敏试验结果一致,显示对氨苄西林(6mm/>256μg/ml)､亚胺培南(6mm/>32μg/ml)､头孢呋辛(6mm/>32μg/ml)和复方新诺明(6mm/>32μg/ml)耐药,对氨曲南(26mm/2μg/ml)､氯霉素(32mm/2μg/ml)､环丙沙星(30mm/0.008μg/ml)､头孢曲松(26mm/0.25μg/ml)､头孢吡肟(26mm/2μg/ml)､左旋氧氟沙星(32mm/0.016μg/ml)､美罗培南(24mm/0.125μg/ml)､利福平(25mm/0.25μg/ml)､头孢他啶(26mm/0.25μg/ml)､四环素(29mm/0.5μg/ml)和头孢噻肟(26mm/1μg/ml)均敏感｡见表1｡

表1菌株药敏试验结果

2.4分子生物学鉴定菌株β-内酰胺酶耐药基因为TEM-1型｡ftsI基因编码区发现有16个氨基酸突变位点,其中P31S､L165S､A239E､V436A､V547I､N569S､A586S､S594T和A595T为本研究发现的氨基酸突变新位点｡见表2｡

表2ftsI基因编码区氨基酸置换位点类型

3、讨论

流感嗜血杆菌是儿童呼吸道感染的主要致病菌｡中国儿童细菌耐药监测数据显示,2022年流感嗜血杆菌占比从2021年的第4位上升至第2位[4,7],表现为不同地域､不同季节和不同年龄人群流感嗜血杆菌感染的流行和耐药模式存在差异[8]｡随着氨苄西林耐药菌株的出现和广泛播散,头孢曲松等三代头孢菌素逐渐成为治疗儿童流感嗜血杆菌感染的首选药物,本研究病例明确病原菌后,使用头孢曲松治疗且有效｡然而,近年来国外分子流行病学报道了亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌,因此,探讨其耐药机制尤为重要｡

碳青霉烯类抗生素与青霉素结合蛋白(PBPs)具有高度亲和力,通过抑制细菌细胞壁合成发挥杀菌作用[9]｡PBP3结构改变是流感嗜血杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一｡PBP3由ftsI基因编码合成,ftsI基因突变影响PBP3的构象,导致PBP3与β-内酰胺类抗生素亲和力降低,使得耐药性增强[10-11]｡有文献报道,流感嗜血杆菌的PBP3氨基酸发生R517H､N526K､M377I､S385T和L389F置换可降低头孢菌素敏感性[12-13],国外学者陆续报道R517H､N526K､D350N､S357N和L389F等在内的多个氨基酸突变与流感嗜血杆菌对亚胺培南耐药有关,然而,PBP3氨基酸突变可能与亚胺培南最低抑菌浓度(MIC)升高无关[14-17]｡另有人报道流感嗜血杆菌PBP3氨基酸V525_N526insM突变降低碳青霉烯类的敏感性[13],但也有报道称碳青霉烯类耐药菌株没有发现PBP3突变[18]｡基于亚胺培南的复杂分子耐药机制,不同的PBP3突变位点可能提示不同的耐药模式｡

目前国外报道较多NTHi的PBP3氨基酸部分突变与亚胺培南耐药的关系,但国内未见报道｡考虑到国外报道多基于ftsI基因部分片段突变,为了全面了解亚胺培南耐药NTHi的ftsI基因突变模式,本研究对该亚胺培南耐药NTHi菌株PBP3的ftsI基因全序列测序,发现16个氨基酸突变位点,比以往报道的突变位点更多,部分PBP3氨基酸突变位点与国外报道相似[16-17],另有9个新的突变位点,包括P31S､L165S､A239E､V436A､V547I､N569S､A586S､S594T和A595T,这可能是导致其对碳青霉烯类抗生素耐药性增强的原因｡推测该菌株ftsI基因突变后引起PBP3蛋白结构改变,与亚胺培南的亲和力下降,从而影响NTHi对亚胺培南的敏感性｡本研究显示该菌株对氨苄西林､头孢呋辛和复方新诺明和亚胺培南耐药,而美罗培南敏感,而且对三代头孢菌素类药物仍敏感,这种耐药表型之前曾有报道[19]｡推测可能还是PBP3突变位点不同,导致蛋白构象改变,造成对β-内酰胺类抗生素的亲和力不同,最终导致其不同抗菌药物的耐药性不同｡值得关注的是,有报道称,PBP3氨基酸突变与亚胺培南耐药性无关[20],考虑到亚胺培南的异质性耐药特点,NTHi对亚胺培南的复杂的分子耐药机制仍有待深入研究｡

既往报道亚胺培南耐药NTHi多为β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药(BLNAR)[15],本研究中NTHi菌株为β-内酰胺酶阳性,TEM-1型,为β-内酰胺酶阳性氨苄西林耐药(BLPAR)｡国内有报道30株亚胺培南耐药菌株,其中β-内酰胺酶阴性氨苄西林敏感(BLNAS)菌株7株､BLPAR菌株15株和BLNAR菌株8株[17],但没有进行亚胺培南耐药分子机制研究｡因此,通过既往研究和本研究结论,不难发现相同耐药表型的菌株,其分子耐药机制可能相同或不同,反之亦然｡目前,亚胺培南对流感嗜血杆菌的耐药机制尚未完全明确,推测不同表型菌株对亚胺培南的耐药机制可能包括:非β-内酰胺酶耐药机制､亚胺培南的异质性耐药机制和或β-内酰胺酶与其他耐药机制共同作用｡随着流感嗜血杆菌多重耐药菌株陆续报道,需要引起广泛关注[21],对于体外药敏试验中亚胺培南耐药流感嗜血杆菌菌株应引起高度重视,尤其是儿童患者,及时通知临床医生,避免亚胺培南的滥用,要选择头孢曲松等其他抗菌药物,以免增加菌株的耐药性传播｡

总之,ftsI基因突变可能是亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌的耐药机制之一;不同突变位点可能导致β-内酰胺类抗生素的不同的耐药表型,本研究为今后进行耐药机制深入研究和临床药物选择提供了理论依据和参考｡由于本研究仅分析了1株亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌的ftsI基因突变情况,还需要收集更多样本进行论证｡同时,鉴于亚胺培南耐药流感嗜血杆菌的异质性耐药特征,需要多中心的进一步验证｡

参考文献:

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文章来源:李保林,王猛,赵运胜.亚胺培南耐药的流感嗜血杆菌ftsI耐药基因位点分析[J].中国国境卫生检疫杂志,2025,48(02):112-115+143.