脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是脊柱损伤中最严重的并发症，如不及时治疗，易引起损伤节段以下的肢体功能障碍，给患者带来巨大身心压力、降低其生活质量，SCI还可导致社会经济损失，有效防治SCI成为学术界亟需解决的问题。研究发现，高压氧可以明显抑制与NgR介导信号通路相关m RNA的表达，从而改善受损脊髓周围环境，促进脊髓的生长与修复[1-2]。电针作为传统的中医康复疗法，技术已经趋于成熟和完善。孙忠人等[3]概述了电针在SCI中促神经修复的机制可能为通过负调控轴突生长抑制因子Nogo-A、NgR及OMgp的表达，从而减少胶质瘢痕形成、促进轴突髓鞘化及神经干细胞的分化与再生。虽然电针治疗SCI的研究颇有进展，但其治疗机制仍待讨论，目前未能充分指导实践。就大鼠SCI模型而言，改良的Allen's打击法虽然可保持硬脊膜完整性，防止外源性物质进入SCI区域、脊髓暴露及脑脊液外漏，但其所致的脊髓挫伤模型与半横断损伤模型有着共同缺点，即无法较好地确定SCI区域的新生轴突是由损伤的神经再生而来，还是由部分剩余的正常神经组织代偿而成。与之相对，脊髓全横断模型可准确证明轴突再生及确定最有效的治疗策略[4]。本研究通过督脉电针对大鼠脊髓全横断损伤模型进行干预，通过检测大鼠运动功能及Nogo-A、NgRmRNA和蛋白的表达，探讨督脉电针对SCI后脊髓神经元的保护作用及其可能机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

选择Wistar大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，共60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号[SCXK（京）2021-0011]，批号230504605757。大鼠饲养环境温度控制在20～25℃，予标准配方杆状饲料喂养，自由进食水，动物实验伦理批准编号[YSY-DWLL-2021240]。

1.1.2试剂与仪器

TUNEL试剂盒（MK1025，美国Bosterbio公司）；DAB试剂盒（ZLI-9563，北京中杉金桥生物技术有限公司）；无水乙醇（B0301002，北京化工厂）；二甲苯（100212，北京化工厂）；石蜡（100211，上海天贺生物）；苏木素（G1004，武汉servicebio公司）；伊红染液（G1005，武汉servicebio公司）；中性树胶（ZLI-9555，北京中杉金桥生物技术有限公司）；RhoA、ROCK、NogoA、NgR抗体（15596-018，美国Thermo公司）；逆转录试剂盒（A5001，美国Promega公司）。显微镜成像系统（日本尼康）；超薄石蜡切片机（德国Leica）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；PCR仪（美国Biorad公司）；生物信号采集处理器（南京美易科技有限公司）；华佗牌电针治疗仪、华佗牌针灸针（针灸针直径0.25mm、长3 mm，苏州医疗用品有限公司）。

1.2方法

1.2.1 SCI模型的建立

戊巴比妥腹腔麻醉（40 mg/kg）大鼠，固定其于实验台，以第9胸椎为中心，常规备皮、消毒、铺巾，在后正中部位切开皮肤、皮下，切口长3 cm左右，确定第9胸椎棘突并切除其椎弓根，暴露第9胸髓背侧后将脊髓横断切除2 mm，生理盐水冲洗后逐层缝合，局部碘伏消毒。大鼠出现双后肢迟缓性瘫痪，表明脊髓全横断损伤模型成功。SCI术后按摩大鼠膀胱以助其排尿，3次/d；青霉素（0.2 m L/kg）腹腔注射预防感染。

1.2.2分组与干预方法

按随机数字表法将大鼠分为正常对照组、模型组、督脉电针组、高压氧组、高压氧联合督脉电针组，每组12只。正常对照组：只行椎板切除，不造成脊髓损伤，不予任何治疗；模型组：建立SCI模型，未接受督脉电针与高压氧治疗；高压氧组：大鼠造模清醒4 h后置于高压氧舱内，纯氧洗舱15 min，再以0.01 Mpa/min匀速加压直至达到0.2 Mpa为止，稳压30 min，然后间断加纯氧将氧浓度控制在96.5%左右，减压至常压，出舱后放回笼中继续喂养。干预频率为4次/d；督脉电针组：大鼠造模清醒4 h后给予督脉电针干预，选取督脉上的“大椎”、“命门”，频率2 Hz，强度1 m A，干预时间20 min,1次/d，治疗至术后第7天；高压氧联合督脉电针组：予以高压氧联合督脉电针治疗，方法如上所述。

1.2.3检测指标和方法

1.2.3. 1标本采集

SCI模型建立后第7天，治疗结束后行Basso Beattie Bresnahan(BBB）评分，再处死各组大鼠。充分显露大鼠心脏，予升主动脉插管处理后剪开右心耳，先以生理盐水冲洗，再灌洗固定，固定液为4%的多聚甲醛，在确保脊髓完整无损的前提下，提取损伤区脊髓组织。（1)HE染色所需切片组织的获得：取脊髓组织长度约1 cm。（2）透射电镜所需组织的获得：以SCI区为中心，分别于近心端及向心端连续取两段脊髓，长宽分别约为1cm、1 mm。（3）免疫荧光所需组织的获得：剥离损伤区域约1 cm的脊髓组织，并将其以甲醇-20℃于玻片上固定。（4)RT-PCR及Western印迹所需组织的获得：快速取得损伤段脊髓组织1 cm左右，在0～4℃高渗透蔗糖溶液中冰冻3 min并通以100%O2，将脊髓组织切成400μm切片，用低钙羟乙基磺酸钠溶液（HSSB）漂洗3次，将切片置于33℃通有95%O2和5%CO2混合气体的Earle's平衡盐溶液中孵育1.5 h，而后移至低钙HSSB并放入盛有Hanks平衡盐溶液的容器中，继续以100%O2处理。在温度为33℃的酶溶液中酶解30 min，样本继续于低钙HSSB溶液中反复漂洗。吹打，以充分分散样本，即可得分散的神经元。

1.2.3. 2行为学检测

分别于SCI造模术前、术后即刻、术后第1、3和7天应用BBB评分综合评定各组大鼠的运动功能，观察内容如下：早期后肢关节运动情况、中期失调步态、晚期拖着脚趾和躯干失稳等。将实验动物后肢运动分为22个等级，后肢完全瘫痪为0分，活动正常为21分，分数越高对应状况越好。观察人员为熟悉评分标准的非实验人员。

1.2.3.3 TUNEL法检测神经细胞凋亡

采用经典的TUNEL法对大鼠凋亡细胞进行检测，DAB显色，样本置于显微镜下，细胞核呈现为棕褐色说明已凋亡。选5个视野，在镜下数凋亡细胞，在此基础上，进一步确定出阳性率即凋亡指数（AI），为下一环节的分析提供数据支持。

1.2.3. 4 HE染色

将所取脊髓组织用梯度酒精脱水，石蜡切片厚度为3μm。将切片予苏木素染色处理，8 min后用自来水冲洗，继而予盐酸酒精分化处理10 s，并再次予自来水冲洗及伊红染色，时间分别为3 min及30 s。最后冲洗、脱水、透明、封片。冲洗液为自来水，脱水方式为梯度酒精脱水，透明剂为二甲苯，黏合剂为中性树胶。显微镜观察所获损伤区脊髓组织病理变化，放大倍率为物镜下20倍。

1.2.3.5透射电镜观察

将所获脊髓组织予2.5%戊二醛固定过夜，次日在4℃条件下予锇酸固定2 h处理并漂洗后，丙酮梯度脱水，之后以醋酸铀染色4 h，环氧树脂包埋。透射电镜观察并分析神经组织恢复情况。

1.2.3. 6免疫荧光检测RhoA/ROCK通路变化

将固定的脊髓组织以兔抗大鼠RhoA、ROCK抗体（1800）在低温环境下培养16 h，之后采用准备好的磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤30 min，再以山羊抗兔IgG抗体（1 700）于室温环境下培养1 h，再次清洗，荧光显微镜检测神经细胞的RhoA/ROCK表达情况。

1.2.3.7凋亡及分化基因检测

分别收集各组107个细胞，缓冲液反复清洗，接着以准备好的TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，并进一步逆转录为cD-NA，最后予以PCR扩增。加入目标基因相关引物，用以下引物对Nogo-A、NgR及GAPDH的c DNA进行扩增：上游：Nogo-A(145 bp)5'-TGACACAGAGA AAGAGGACAGAT-3';NgR(168 bp)5'-TGCCGACA TGGGTGTTATGG-3';GAPDH(149bp)5'-ACGGCAA GTTCAACGGCACAG-3'。下游：Nogo-A(145bp)5'-CAGAGACAGCAGCAGGAATAAG-3';NgR(168 bp)5'-TGCCGTGCAGGAAGATTCTC-3';GAPDH(149bp)5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'。RT-PCR反应条件：95℃条件下进行5 min预变性，95℃条件下30 s变性，60℃温度条件下退火处理30 s,72℃温度条件下延伸60 s,35个循环。扩增产物经一定的琼脂糖凝胶电泳后，继续使用高精度凝胶成像仪观察。

收集各组107个细胞，PBS冲洗3次，提取总蛋白并测定蛋白浓度。60μg总蛋白质在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h后加入1 1 000稀释的目标蛋白多克隆一抗与膜孵育1 h,TBST洗膜4次，每次15 min；加入1 5 000 HRP标记的二抗和GAPDH,37℃孵育2 h，清洗后，采用ECL试剂盒进行化学发光检测。上述步骤完成后，接着进行X光片压片、显影、定影。采用高分辨率的UVI凝胶成像系统摄像。用Image-Pro Plus 7.0软件分析条带灰度值所得结果。

1.3统计学处理

应用SPSS16.0系统软件处理，符合正态分布的数据以±s表示。正态分布数据多组间比较采用单因素方差分析，各个实验组的两两比较采用最小显著性差异法LSD-t法，非正态分布数据采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1实验动物模型评估

术中暴露脊髓T9节段，见图1A。脊髓全横断后，大鼠出现双后肢弛缓性瘫痪，0级肌力，行走完全依靠前肢负荷，如图1B所示，提示SCI造模成功，数天后，可以明显的观察到病鼠双后肢弥漫性肌萎缩，精神状态萎靡，从而导致厌食，活动量减少，甚至有部分大鼠在术后1周出现压疮、破溃。

图1 SCI模型的建立

2.2 BBB评分

术前所有大鼠BBB评分为21分，正常对照组大鼠术后评分为21分，其余各组SCI术后大鼠评分为0分，损伤后第1、3、7天评分数据经软件处理后实施组间横向对比，具体情况见表1。模型组评分较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05）；督脉电针组、高压氧组和高压氧联合督脉电针组BBB评分均较模型组升高，且以高压氧联合督脉电针组的升高更明显，存在统计学意义（P<0.05）。

表1各组大鼠BBB评分比较（±s)

2.3神经细胞凋亡检测

对提取的损伤区脊髓组织行TUNEL染色，在200×显微镜物镜下观察拍照结果如下（图2）。对照组可观察到较少的TUNEL染色阳性细胞数，而模型组的脊髓灰质区神经细胞染色明显呈阳性，且伴有严重的神经细胞凋亡；相较于模型组，高压氧联合督脉电针组神经细胞染色阳性数偏低，脊髓神经元凋亡指数明显下降[（42.81±5.69）%、（18.37±1.43)%,F=8.329,P<0.05]。

图2脊髓灰质神经细胞凋亡（200×）

2.4 HE染色结果

在显微镜20倍物镜下观察组织形态变化。与正常对照组比较，模型组灰白质病理性出血、水肿、坏死、空泡样化、退变胶质化，神经元和神经胶质细胞显著减少，白质散乱排列，神经束间隙增加，细胞核固缩，神经细胞肿胀、破裂、溶解，大量神经元死亡，已无明显细胞结构神经轴索通过（图3）。与模型组比较，高压氧联合督脉电针组已经有大量神经元和神经胶质细胞再生，脊髓灰质和白质界限分明，白质中可见大量轴突生长，细胞形态结构完整，细胞核清晰可见（图3C）。

2.5透射电镜结果

将SCI部位组织通过TEM方法观察，正常对照组神经纤维束整齐排列，并且可看到完整的神经细胞及细胞核，且线粒体形态及数目正常，溶酶体数量较少，无自噬小体。模型组神经纤维束散乱排列，电镜下可观察到形态异常的线粒体，且肿胀明显、细胞质呈空泡化、异常形态的细胞核、溶酶体及自噬小体，且数量较其他两组明显升高。高压氧联合督脉电针组电镜下可观察到肿胀的神经细胞，线粒体形态稍微不规则，核形正常，核内染色质欠均匀。与模型组比较，游离核糖体及溶酶体的数量水平有所下降，见图4。

2.6 RhoA/ROCK表达水平结果

各组与模型组相比较的RhoA、ROCK蛋白表达见图5，模型组脊髓组织RhoA、ROCKⅡ蛋白表达水平明显高于正常对照组（均P<0.05）；经干预后，督脉电针组、高压氧组和高压氧联合督脉电针组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ蛋白表达水平都明显低于模型组（F=34.597、39.230，均P<0.05）。

图3脊髓组织HE染色（20×）

图4脊髓组织透射电镜

图5 RhoA、ROCK蛋白的表达

2.7 Nogo-A、NgR m RNA及蛋白表达结果

经单因素方差分析和LSD-t检验后得出各组间比较的基因及蛋白表达浓度均值（表3、图6），模型组大鼠脊髓组织Nogo-A、NgR的m RNA和蛋白表达水平均明显高于正常对照组（均P<0.05）；治疗后，督脉电针组、高压氧组和高压氧联合督脉电针组大鼠脊髓组织Nogo-A、NgR的m RNA和蛋白表达水平均较模型组明显降低，以高压氧联合督脉电针组的降低更加显著，差异具有统计学意义（F=14.783、21.435、12.370、50.435，均P<0.05）。

表3各组大鼠Nogo-A、NgR m RNA及蛋白表达水平比较（±s)

图6 Nogo-A及NgR的蛋白表达

高压氧联合督脉电针组；A:Nogo-A的Western印迹实验；B:NgR的Western印迹实验；与正常对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05；与督脉电针组相比，△P<0.05；与高压氧组相比，****P<0.05

3、讨论

电针治疗可促进SCI的修复，在临床运用中取得不错的治疗效果，但其分子生物学机制比较复杂，并不十分明确。其可能的机制为促进神经修复、抑制炎症以及改善微环境等[5-7]。细胞凋亡是生物体的自然规律，在维持神经内环境稳定中起着重要作用，是SCI的主要诱发因素[8-9]。当中枢神经系统损伤时，神经细胞凋亡在神经功能丧失这一过程中可能起到了主导作用[10-11]。本研究显示，SCI组术后凋亡细胞数明显升高，由此推测SCI过程中存在细胞凋亡。病鼠给予督脉电针干预后，其神经元细胞凋亡得到明显抑制，动物身体恢复更快，这与以往研究结论一致[12]。但对督脉电针激活人类自噬的机制尚未完全阐明，还需进行更深入的探讨。

SCI后，在中枢神经系统髓鞘中有3种主要影响神经轴突再生和修复的髓鞘相关抑制因子，分别是Nogo蛋白、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（OMgp)[13-14]。拮抗或阻断这些抑制因子的信号通路，可促进中枢神经损伤后的轴突再生。相关抑制因子中以Nogo蛋白作用最为突出，Nogo-A是神经生长抑制因子中最为常见的一种异构体。现代医学研究表明，其受体NgR位于神经元表面，能够与配体Nogo-66结合，从而将信息传输至神经元胞体内，并在下游信号通路的参与下，起到阻止轴突生长的效用[15-16]。一系列研究结果表明，给予电针治疗可以较大程度抑制病鼠脊髓组织中Nogo-A m RNA的水平[10]。近年来的一些研究发现，该方法是通过阻止Nogo-A和NgR的表达来发挥SCI治疗作用[7]。当前比较公认的是对于SCI治疗应争取“三早”原则，即早期用药和手术，及早控制病情[17]。但如何界定“早期”的概念，如何达到早期的治疗，并无确切的判定标准[18]。实验研究方面，动态观察SCI大鼠BBB评分和电针对Nogo-A、NgR时相表达的影响，即时间窗效应，可能是解决如何判定“早期”的途径之一。李启超等[19]构建了脊髓全横断模型，同时设置对照组；之后对病鼠组织进行检测，显示Nogo-A蛋白表达呈递增趋势，两周后达到峰值；对病鼠进行电针治疗后Nogo-A水平显著降低。研究发现，模型组Nogo-A、NgR m RNA等指标水平均有不同程度的升高；经电针治疗后各指标水平均较不予干预的对照组更低。由此推测，电针于SCI恢复期介入疗效可能更佳。这一研究结果与高连军等[20]研究有相同之处。根据以往的临床经验来看，SCI患者早期往往存在多脏器的功能障碍，及早干预有助于缓解病情，但有学者指出术后病情稳定时的疗效可能更理想。尽管高连军等[20]的研究结论是SCI后电针刺激介入的时间越早，治疗效果越好，但从研究报道的具体内容来推断，这一结论有待商榷。根据实际情况，临床上SCI患者通常在手术拆线后接受针灸干预。本文通过构建动物模型，对其进行一系列BBB评分并予以电针治疗，之后检测病鼠Nogo-A、NgR表达水平，发现该疗法在SCI早期介入能够控制病情，但是恢复期介入可能疗效更显著。

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基金资助:天津市卫生局中医中西医结合科研课题(2021141);

文章来源:封怡辉,聂统琨,王东.督脉电针和高压氧对脊髓损伤大鼠脊髓神经元的作用机制探讨[J].天津医科大学学报,2024,30(04):343-349.