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大黄素调控FGF19/FGFR4通路抑制肝星状细胞活化抗肝纤维化机制研究

2024-10-21 47 上传者：管理员

摘要：目的探究大黄素调控FGF19/FGFR4通路抑制肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）活化的抗肝纤维化机制。方法体外培养人HSC细胞株LX-2细胞，将LX-2细胞分为对照组、大黄素低剂量组、大黄素高剂量组、H3B-6527组（FGF19/FGFR4信号通路抑制剂）、大黄素高剂量+oe-NC组、大黄素高剂量组+oe-FGFR4组。CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，qRT-PCR实验检测细胞FGF19和FGFR4基因表达；Western blotting检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4蛋白水平。结果与对照组相比，大黄素低、高剂量组和H3B-6527组LX-2细胞OD450（24 h、48 h）值、FGF19 mRNA、FGFR4 mRNA表达、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、Bcl-2、FGF19、FGFR4蛋白表达显著降低，凋亡率和Bax蛋白表达显著升高（P<0.05）;与大黄素高剂量组相比，H3B-6527组LX-2细胞各项检测指标差异无统计学意义（P>0.05）;过表达FGFR4减弱了大黄素对LX-2细胞行为及以上蛋白表达的影响。结论大黄素通过抑制FGF19/FGFR4通路可抑制HSC的生物学活性进而实现抗肝纤维化的作用。

关键词：
FGF19/FGFR4通路
大黄素
肝星状细胞
肝纤维化
肝脏损伤
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肝纤维化主要是指肝脏损伤后细胞外基质在大量沉积，肝纤维化持续发展会导致肝硬化进而引起死亡，目前，每年约有100万人死于肝硬化[1]。肝纤维化的主要原因是肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)被激活后大量增殖和活化，活化的HSC过量表达细胞外基质成分，沉积于狄氏间隙和肝细胞坏死区，进一步导致肝组织发生病理性改变，促进肝纤维化的发展[2-3]。因此，抑制HSC增殖和活化是治疗肝纤维化的关键。大黄素主要是从大黄、何首乌等中药中提取的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理特性，有研究表明大黄素具有抑制器官纤维化的作用[4]。张峰等[5]研究表明，大黄素通过促进Nur77表达可诱导HSC衰老死亡进而抑制肝纤维化。梁宝瑜[6]研究表明，大黄素可抑制HSC谷氨酰胺代谢和活化，诱导其衰老和凋亡，发挥其抗纤维化作用。大量研究表明，FGF19/FGFR4信号通路在细胞增殖、迁移、分化等过程中发挥重要的调控作用[7]。Raja等[8]研究表明，FGF19/FGFR4信号通路可肝癌细胞中过表达，抑制该通路可抑制肝癌细胞增殖和迁移。Liu等[9]研究表明，抑制FGF19/FGFR4通路可抑制肝癌的发生发展，激活FGF19/FGFR4通路可促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。推测FGF19/FGFR4通路也可促进HSC增殖和活化。因此本研究就大黄素是否通过调节FGF19/FGFR4通路进而对肝纤维化发挥治疗作用进行探讨。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验细胞：

人HSC LX-2细胞购自武汉原生原代生物公司。

1.1.2主要试剂：

RPMI 1640培养基购自河南恩硕生物科技有限公司(YT3048);胎牛血清购自南京森贝伽生物科技有限公司(BC-SE-FBS08);Trizol试剂购自泰州云科生物技术有限公司(QK4031S);总RNA提取试剂盒(41-5842)、qRT-PCR试剂盒(LH-5863)购自郑州隆之鼎商贸有限公司；CCK-8试剂盒购自江苏慧智生物科技有限公司(WG1347T);细胞凋亡检测试剂盒购自百克赛斯生物科技有限公司(SH826-7);蛋白提取试剂盒购自上海舒话生物科技有限公司(TK2684);Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4抗体购自英国Abcam公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与分组：

将LX-2细胞接种于RPMI 1640培养基中进行培养，待细胞长满培养瓶底部后加入胰蛋白酶消化传代，进行后续实验。

将对数生长期LX-2细胞分为对照组、大黄素低剂量(20 mol/L)组、大黄素高剂量(40 mol/L)[6]组、H3B-6527(1 mol/L)组[10](FGF19/FGFR4信号通路抑制剂)、大黄素高剂量+oe-NC组(转染oe-NC后用40 mol/L大黄素处理)、大黄素高剂量组+oe-FGFR4组(转染oe-FGFR4后用40 mol/L大黄素处理);对照组无任何处理，其他各组细胞添加相应药物和转染处理，培养48 h后，进行后续实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：

将各组LX-2细胞以每孔5×104个接种到96孔板中，培养48 h时，弃去上清液，于各孔中加入含有10μL CCK-8溶液的100μL完全培养基，孵育2 h后，酶标仪测定各孔OD值(450 nm)。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡：

将各组LX-2细胞接种在96孔板中，每孔1×105个细胞，37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养过夜，0.25%胰蛋白酶消化细胞，用PBS缓冲液洗涤后，离心收集细胞(1 000g离心5 min),根据凋亡试剂盒说明书步骤，加入Annexin V-FITC与PI试剂，室温避光反应15 min,上样用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.2.4 qRT-PCR检测FGF19、FGFR4基因表达：

使用Trizol试剂提取各组LX-2细胞中的总RNA,将RNA逆转录为cDNA后，以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。FGF19 mRNA、FGFR4 mRNA以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt方法计算FGF19 mRNA、FGFR4 mRNA的相对表达量。引物：FGF19正向：5′-GCACAGTTTGCTGGAGATCA-3′;反向：5′-ATCTCCTCCTCGAAAGCACA-3′;FGFR4正向：5′-AGCACCCTACTGGACACACC-3′;反向：5′-ACGCTCTCCATCACGAGACT-3′;GAPDH正向：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′;反向：5′-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。

1.2.5 Western blotting法检测LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4蛋白的表达：

提取各组LX-2细胞中总蛋白质，并检测蛋白浓度，对蛋白进行变性，用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白、转膜，50 g/L脱脂奶粉溶液中封闭2 h,加入一抗Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4、GAPDH,4℃反应过夜。洗膜后HRP标记兔抗鼠二抗反应40 min,加入ECL发光液，用Image-Pro Plus软件分析蛋白质。

1.3统计分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析；计量资料采用表示；单因素方差分析用多组间比较用，采用SNK-q检验进行组内两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1大黄素对LX-2细胞生长的影响

大黄素低、高剂量组和H3B-6527组LX-2细胞OD450(24 h、48 h)值低于对照组(P<0.05);与大黄素高剂量组相比，H3B-6527组LX-2细胞OD450(24 h、48 h)值差异无统计学意义(P>0.05);与大黄素高剂量+oe-NC组相比，大黄素高剂量+oe-FGFR4组LX-2细胞OD450(24 h、48 h)值显著升高(P<0.05,见表1)。

2.2大黄素对LX-2细胞凋亡的影响

大黄素低、高剂量组和H3B-6527组LX-2细胞凋亡率高于对照组(P<0.05);与大黄素高剂量组相比，H3B-6527组LX-2细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);与大黄素高剂量+oe-NC组相比，大黄素高剂量+oe-FGFR4组LX-2细胞凋亡率显著降低(P<0.05,见表2、图1)。

表1各组LX-2细胞增殖能力比较

表2各组LX-2细胞凋亡率比较

图1流式细胞术检测各组LX-2细胞凋亡结果

2.3大黄素对LX-2细胞FGF19 mRNA、FGFR4 mRNA表达的影响

大黄素低、高剂量组和H3B-6527组LX-2细胞FGF19 mRNA、FGFR4 mRNA表达低于对照组(P<0.05);与大黄素高剂量组相比，H3B-6527组LX-2细胞FGF19 mRNA、FGFR4 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);与大黄素高剂量+oe-NC组相比，大黄素高剂量+oe-FGFR4组LX-2细胞FGF19 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),FGFR4 mRNA表达显著升高(P<0.05,见表3)。

2.4大黄素对各组LX-2细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达影响

大黄素低、高剂量组和H3B-6527组LX-2细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达低于对照组(P<0.05);与大黄素高剂量组相比，H3B-6527组LX-2细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与大黄素高剂量+oe-NC组相比，大黄素高剂量+oe-FGFR4组LX-2细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达显著升高(P<0.05,见表4、图2)。

2.5大黄素对各组LX-2细胞Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4蛋白表达影响

大黄素低、高剂量组和H3B-6527组LX-2细胞Bcl-2、FGF19、FGFR4蛋白表达低于对照组，Bax蛋白表达高于对照组(P<0.05);与大黄素高剂量组相比，H3B-6527组LX-2细胞Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与大黄素高剂量+oe-NC组相比，大黄素高剂量+oe-FGFR4组LX-2细胞Bcl-2、FGFR4蛋白表达显著升高，Bax蛋白表达显著降低(P<0.05),FGF19蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05,见图3、表5)。

表3各组LX-2细胞FGF19 mRNA、FGFR4 mRNA比较

图2各组LX-2细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达

表4各组LX-2细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达水平比较

图3各组LX-2细胞Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4蛋白表达

表5各组LX-2细胞Bcl-2、Bax、FGF19、FGFR4蛋白表达水平比较

3、讨论

肝纤维化的特征是肝脏损伤后细胞外基质过度积累的病理过程，可过度发展成为肝硬化和肝癌[11]。许多因素包括慢性病毒感染、酒精滥用和非酒精性脂肪性肝炎均可能引起肝纤维化[12]。活化的HSC是纤维化过程中细胞外基质的主要来源，也是肝纤维化的主要效应细胞，有研究证实促进活化型HSC衰老死亡可以减少细胞外基质生成和沉积，是治疗肝纤维化的一个研究方向[13]。因此，探索HSC活化的机制并诱导其衰老死亡，开发诱导其活化的新药，对于提高肝纤维化患者的治疗具有重要意义。大黄素是从传统中药中提取的一种蒽醌衍生物，现代医学表明，其具有抗肿瘤、抗炎症、抗纤维化等多种生物学功能[14]。Liang等[15]研究表明，大黄素可诱导HSC凋亡，缓解四氯化碳诱导的小鼠肝损伤。张兵兵等[16]研究表明，大黄素可抑制HSC增殖进而减轻酒精诱导的肝纤维化。推测大黄素可能对肝纤维化有一定的治疗作用。

大量研究表明，HSC是肝脏分泌细胞外基质的主要场所，正常情况下HSC仅合成少量胶原细胞外基质，HSC被激活后，其会转化为具有增生性和纤维原性的肌成纤维细胞，该细胞会过量表达α-SMA,过量的α-SMA蛋白可刺激细胞产生并分泌大量胶原蛋白Col-Ⅰ和Col-Ⅲ,这两种蛋白会抑制细胞外基质降解，促进细胞外基质积累沉积，从而诱发肝纤维化[17]。由此可见，α-SMA可反映HSC活化情况，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ可反映细胞外基质沉积情况。本研究结果表明，大黄素干预后可显著降低Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达，减轻肝纤维化。Bcl-2/Bax是调控细胞凋亡的关键蛋白，Bcl-2蛋白具有抑制多种凋亡蛋白激活、线粒体破裂的作用，可抑制细胞凋亡。Bax促凋亡蛋白，可激活凋亡蛋白，破坏线粒体结构等，可促进细胞凋亡[18]。本研究结果证实，大黄素干预后可显著调控Bcl-2和Bax蛋白表达，抑制LX-2细胞活力，促进其凋亡。提示大黄素可通过抑制LX-2细胞活力，通过调控Bcl-2/Bax蛋白表达促进其凋亡，并降低细胞外基质沉积，与推测结果一致。

成纤维生长因子FGF19是一种分泌蛋白，成纤维生长因子受体FGFR4是FGF19的特异性结合蛋白。FGF19/FGFR4通路在细胞生理代谢过程中发挥重要的调节作用，如细胞增殖、组织修复、血管生成等[19]。Kanzaki等[19]研究表明抑制FGF19/FGFR4通路可抑制肝癌细胞生长。Li等[20]研究表明，与健康肝组织相比，FGF19、FGFR4在脂肪肝、肝硬化和肝癌组织细胞中表达显著增加，且与肝组织病理学损伤程度呈正相关。本研究结果显示，对照组LX-2细胞中FGF19、FGFR4基因和蛋白表达水平较高，大黄素可显著降低FGF19、FGFR4基因和蛋白表达。H3B-6527为FGF19/FGFR4通路抑制剂，H3B-6527干预后各检测指标与大黄素高剂量组处理结果处于同一水平。提示大黄素可能是通过抑制FGF19/FGFR4通路实现抗肝纤维化的作用。为进一步证实该结论，本实验在大黄素干预的基础上上调FGFR4表达，经过表明，过表达FGFR4可部分逆转大黄素对HSC的抑制作用。综上，大黄素通过抑制FGF19/FGFR4通路可抑制HSC活化增殖，并促进其凋亡，从而实现抗纤维化作用。

综上所述，大黄素通过抑制FGF19/FGFR4通路可抑制HSC增殖，并促进其凋亡，减少细胞外基质合成，从而实现抗肝纤维化的作用。本实验仅在细胞水平进行探究，缺少动物实验验证，后续还需进行动物实验证实。

参考文献:

[4]杨春昆,潘清泉,罗传超,等.大黄素抑制纤维化的机制综述[j].世界中西医结合杂志,2023,18(6):1266-1272.

[5]张峰,陈利,梁宝瑜,等.大黄素通过核受体nUR77诱导肝星状细胞衰老并减轻肝纤维化[j].中国药理学与毒理学杂志,2021,35(10):755-764.

[6]梁宝瑜.大黄素通过调控谷氨酰胺代谢诱导肝星状细胞衰老抗肝纤维化机制研究[d].南京:南京中医药大学,2021.

[16]张兵兵,李三强,王子仪,等.小白菊内酯､含笑内酯､(+)-aINSLIADIMER a和大黄素对活化后肝星状细胞增殖能力的影响[j].胃肠病学和肝病学杂志,2023,32(1):65-70.

[18]郑洋,徐灿丽,卢能源,等.基于肝星状细胞自噬和凋亡探讨莪术醇抗肝纤维化的作用机制[j].中国中药杂志,2022,47(3):730-736.

文章来源:汤琴,陶茹,赵彤芳,等.大黄素调控fgf19/fgfr4通路抑制肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究[j].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(10):1286-1290.