非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常见的慢性肝脏疾病，包括一系列组织学和病理学特征改变，从以肝脏脂肪堆积为特征的肝脂肪变性，到与肝细胞炎症、纤维化相关的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)，最终发展为肝硬化、肝癌甚至肝衰竭[1]。虽然肝脂肪变性被认为是一种良性疾病，但其与肝纤维化的关系被认为是调节肝脏相关全因死亡率的重要因素[2]。NAFLD还与代谢综合征和病毒性肝炎相关的终末期肝病有关，已成为美国肝移植第二大常见指征[3-4]。

多年来，“二次打击”假说一直被认为是NAFLD的主要发病过程，即首先出现的症状是代谢异常（如久坐、高脂饮食（high-fat diet,HFD）等导致肥胖和胰岛素抵抗）引起的肝内脂肪堆积[5]；此时，过量的脂质会使肝脏对未知的“二次打击”敏感，这也是NAFLD向NASH发展的重要原因。近年来，这一理论已被“多重打击”假说取代，该假说能更好地解释该疾病的复杂性和临床演变性[5]。肝脏首先发生毒性脂质累积，如甘油三酯（triglyceride,TG）、游离脂肪酸等脂质代谢物的数量增加，进而触发一系列脂毒性反应。在这种情况下，一个长期的修复过程会导致肝细胞改变，如肝星状细胞激活以及肝组织中细胞外基质沉积等病理改变[6-7]。这一损伤-修复过程导致了肝脏中大量的自由基产生，被认为是NAFLD脂毒性的关键步骤，进一步导致肝细胞脂质过氧化以及异常信号转导[6]。饮食运动干预被公认为是NAFLD患者的一线治疗措施，能有效减少肝内脂肪累积，逆转疾病进程[8]。

我们之前的研究发现，游泳运动（swimming excercise,SE）对高脂饮食小鼠肝脏脂质积累有保护作用，能够减轻肝细胞损伤[9]。但是该研究未进一步探究高脂饮食小鼠的肝脏脂质代谢谱变化，寻找能够表征疾病或干预疾病进程的关键脂质分子。本研究基于液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)，通过高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠构建NAFLD模型，并通过游泳运动进行干预，12周后取小鼠肝组织行非靶向脂质组学检测，首次从脂质代谢角度研究NAFLD被改变的脂质组成和表达量，并初步探究游泳运动对脂质代谢的改善作用，为进一步的机制研究和靶向干预提供线索和依据。

1、材料与方法

1.1实验动物和器材

SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠27只，由陆军军医大学实验动物中心提供[生产许可证号：SCXK(渝)20170002；使用许可证号：SYXK(渝)20170002]；小鼠在SPF级屏障环境中饲养，温度为25℃，湿度为60%。所有动物实验均获得陆军军医大学实验动物伦理审查委员会批准（伦理批号：AMUWEC2023）。

Q Exactive plus质谱仪(Thermo Scientific™，美国)，UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱仪(SHIMADZU，日本)，低温高速离心机(Eppendorf 5430R，德国)，色谱柱：Waters,ACQUITY UPLC CSH C18,1.7µm,2.1 mm×100 mm column(SHIMADZU，日本)。

1.2动物模型构建

将27只小鼠随机分为对照组、高脂饮食组（HFD组）、高脂饮食+游泳运动组（HFD+SE组），每组9只。对照组：标准喂养12周，10%热量来自脂肪；HFD组：高脂饮食喂养12周，60%热量来自脂肪；HFD+SE组：高脂饮食喂养12周，60%热量来自脂肪，同时进行为期12周的游泳运动[9]。12周后取小鼠肝组织于-80℃保存以待送样分析。

1.3实验样品和质控(quality control,QC)样品制备

将小鼠肝组织4℃解冻后，取样品50 mg，加200µL超纯水匀浆。随后加入240µL预冷甲醇进行涡流混合，加入800µL甲基叔丁基醚进行涡流混合。然后室温放置20 min，以8 000 g、10℃离心15 min，取上层有机相，氮气吹干。质谱分析前，加入200µL异丙醇溶液再溶解，以8 000 g、10℃离心15 min，取上清进行LC-MS分析。每组取等量样品，混合入质控池作为质控样品。

1.4 LC-MS检测

1.4.1色谱条件

样品采用UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱系统进行分离。柱温45℃，流速300µL/min，进样量2µL。流动相组成A:10 mmol/L甲酸铵乙腈水溶液（乙腈∶水=6∶4,v/v);B:10 mmol/L甲酸铵乙腈异丙醇溶液（乙腈∶异丙醇=1∶9,v/v）。梯度洗脱程序：0～7 min,B维持在30%;2～25 min,B从30%线性变化至100%;25～30 min,B维持在30%。整个分析过程中样品置于10℃自动进样器中。

1.4.2质谱条件

样品经液相色谱系统分离后，采用Q Exactive plus质谱仪进行质谱分析。采用电喷雾电离技术，正离子模式参数：Heater Temp 300°C,Sheath Gas Flow Rate 45 arb,Aux Gas Flow Rate 15 arb,Sweep Gas Flow Rate 1 arb,spray voltage 3.0 kV,Capillary Temp 350℃，S-Lens RF Level 50%.MS1scan ranges:200～1 800；负离子模式参数：Heater Temp300°C,Sheath Gas Flow Rate 45 arb,Aux Gas Flow Rate 15 arb,Sweep Gas Flow Rate 1 arb,spray voltage2.5 kV,Capillary Temp 350℃，S-Lens RF Level 60%.MS1scan ranges:250～1 800。

1.5数据质控和统计学分析

采用LipidSearch software version 4.1(Thermo Scientific™，美国）和SIMCA-P 14.1(Umetrics,Umea,瑞典）软件进行脂质鉴定、模式识别、数据质控等分析。数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维统计分析，包括主成分分析（principal component analysis,PCA），正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）；单维统计分析包括t检验；R软件绘制层次聚类分析热图。

2、结果

2.1 PCA分析

PCA模型参数为R2X(cum)=0.862,Q2(cum)=0.792，表明该模型能够稳定可靠地反映对照组、HFD组和HFD+SE组间的脂质组学分布差异，且差异有统计学意义，见图1。

图1 3组PCA得分图

R2X(cum)=0.862,Q2(cum)=0.792

2.2 OPLS-DA分析和置换试验

OPLS-DA分析显示，HFD组和对照组的脂质组学分布有显著差异（图2a）；同时，置换试验参数为R2Y(cum)=1,Q2(cum)=0.933,Q2intercept<0.05，证明该模型稳定性、准确性和可预测性良好(图2b)。HFD+SE组与HFD组的脂质组学分布也有显著差异（图2c）；同时，置换试验参数为R2Y(cum)=0.997,Q2(cum)=0.993,Q2intercept<0.05，证明该模型稳定性、准确性和可预测性良好(图2d)。

图2 OPLS-DA得分图和置换试验

2.3显著性差异脂质化合物鉴定

采用LC-MS检测了3组共27个小鼠肝脏样品，共鉴定了903种脂质化合物。结果显示，HFD组与对照组比较，有81种差异脂质化合物(OPLS-DA VIP>1,P<0.05);HFD+SE组与HFD组比较，有27种差异脂质化合物(OPLS-DA VIP>1,P<0.05)。差异脂质化合物主要归属于甘油酯类、甘油磷脂类和鞘脂类。显著性差异脂质化合物鉴定结果见图3。

2.4显著性差异脂质聚类分析

热图每一行显示了差异脂质化合物的表达情况，每一列显示了每个样本的肝脏脂质组学特征。色带指示了显著性差异脂质化合物的表达水平，越接近绿色表示该脂质化合物下调越明显，越接近红色表示该脂质化合物上调越明显。HFD组与对照组比较，小鼠肝脏脂质代谢谱表达上调的脂质化合物较多；HFD+SE组与HFD组比较，小鼠肝脏脂质代谢谱既有表达上调的脂质化合物，也有表达下调的脂质化合物，见图4。

3、讨论

随着现代生活方式的改变，NAFLD发病率逐年增加，成为我国患病率最高的慢性肝脏疾病[10]。以往的研究认为，肝脂性凋亡、线粒体功能障碍、氧化应激、自噬和炎症均促进了NAFLD向NASH进展[11]。目前临床上尚缺乏治疗NAFLD的有效药物，主要通过饮食运动干预延缓疾病进程[12]。因此，深入探究NAFLD的发病机制，寻找表征疾病进展的特征性生物标志物，发现有效的治疗靶点至关重要。

本研究从全新的脂质组学角度出发，借助基于LC-MS的非靶向脂质组学技术，检测对照组、HFD组和HFD+SE组小鼠的差异表达脂质。其中，HFD组与对照组比较，有81种差异脂质化合物；HFD+SE组与HFD组比较，有27种差异脂质化合物。根据国际脂质分类和命名委员会（International Lipid Classification and Nomenclature Committee,ILCNC）的分类标准，本研究所鉴定到的差异脂质化合物主要归属于甘油酯类、甘油磷脂类和鞘脂类[13]。

图3 显著性差异脂质化合物

3.1甘油酯类差异脂质

本研究鉴定到的甘油酯类差异脂质主要有TG和甘油二酯（diglyceride,DG），见图3。相关研究表明，肝内TG产生和分泌失衡是肝脂肪变性的重要因素，当肝脏新生脂肪生成和从循环中摄取的脂肪酸超过了肝脏β-氧化能力和以极低密度脂蛋白形式分泌TG的能力时，会导致肝脂肪变性，进一步引起肝细胞功能紊乱和代谢变化，使细胞更易受氧化应激的影响[14-15]。Puri等[16]的人群研究发现，从对照组到肝脂肪变性组再到NASH组，平均TG/DG比值逐步升高(7 vs.26vs.31,P<0.001)；且对照组和肝脂肪变性组比较，NASH组和肝脂肪变性组比较，肝脏ω-6/ω-3比值均有差异（P<0.05)。本研究进一步证实了现有的证据，NAFLD组小鼠肝脏TG表达明显增加，即肝脏TG积累是NAFLD的重要标志。其次，NAFLD小鼠DG水平也显著升高。据报道，DG也是重要的脂毒性物质，会导致胰岛素抵抗，加速NAFLD向NASH进展[17]。

图4 正离子模式下显著性差异脂质层次聚类分析热图

值得注意的是，这些改变的TG和DG所结合的脂肪酸类型多以长链胞和脂肪酸和单不胞和脂肪酸居多，提示较低的不饱和键脂肪酸含量与甘油酯类的脂毒性有关。以往普遍认为，肝脏游离脂肪酸升高是NAFLD肝细胞损伤和死亡的主要原因[18-19]。本研究通过新的研究技术发现NAFLD小鼠肝脏总脂质含量增加时，游离脂肪酸含量并未发生改变，推测可能是由于肝脏尚能代偿多余的游离脂肪酸。

3.2甘油磷脂类差异脂质

磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE）是哺乳动物体内含量最丰富的甘油磷脂类，前者是细胞膜结构的重要成分，后者主要分布于线粒体内膜[20-21]。由于磷脂酶和溶血卵磷脂酰基转移酶的作用，PC和PE的酰基链成分可以被重塑，因此在哺乳动物细胞中存在着丰富的PC和PE分子种类，如溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine,LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine,LPE）等。本研究脂质组学结果提示，NAFLD小鼠肝脏存在多种甘油磷脂类脂质化合物（PC、PE、LPC、LPE等）改变。在一些小鼠模型和人群研究中发现PC和PE的摩尔比的变化是肝脏健康的关键决定因素：肝PC/PE比值变化与NAFLD的发展[22]、肝衰竭[22]、肝再生受损[23]和酒精性脂肪性肝病的严重程度均有关[24]。

3.3鞘脂类差异脂质

鞘脂不仅是细胞膜的组成成分，且参与多种生物学过程，包括血管生成、基因表达、细胞增殖、细胞分化、衰老和凋亡等[25]。其中，神经酰胺（ceramide,Cer）在NAFLD的机制研究中备受关注。研究表明，神经酰胺可促进胰岛素抵抗发生和线粒体活性氧产生[26]，尤其是神经酰胺前体物质二氢神经酰胺与胰岛素抵抗有关，NASH患者肝内二氢神经酰胺浓度增加[27]。本研究在NAFLD小鼠上检测到Cer(d18∶1/22∶0)+HCOO的上调和Cer(d18∶1/24∶0+O)+H的下调，提示神经酰胺脂质化合物代谢紊乱参与了NAFLD的发生和进展。调节二氢神经酰胺/神经酰胺比值有望成为治疗NAFLD的靶点[28]。一项研究分析了神经酰胺从头合成途径抑制剂多球壳菌素（Myriocin）对4～6周大鼠的影响，结果发现，Myriocin处理降低了血浆神经酰胺含量和肝脏TG水平，减少了肿瘤坏死因子-α的表达，缓解了肝脏炎症，并明显减轻了肝脏纤维化[27]。

3.4游泳运动和NAFLD

饮食运动干预是NAFLD治疗的基石，也是一线干预治疗措施[29]。一项动物研究发现运动干预可以逆转高脂饮食SD大鼠磷脂类(PC/PE等)含量的改变，维持线粒体功能的发挥[30]。且越来越多的研究发现，各类型的有氧运动和抗阻力训练对NAFLD均有延缓病程的作用[31-32]。一项随机对照试验比较了高强度间歇训练（high-intensity interval training,HIIT）和中等强度有氧运动对糖尿病肥胖合并NAFLD患者的肝内TG和内脏脂质的影响，结果发现两种运动方案均可降低患者肝内TG和内脏脂质水平，且两者效果无显著差异[31]。另一项随机对照试验发现，中等强度有氧运动和抗阻力训练均可减少NAFLD患者肝内脂肪和改善潜在胰岛素抵抗，且两者效果无统计学差异[32]。本研究针对NAFLD小鼠采取的游泳运动的干预方式属于中等强度有氧运动。值得注意的是，NAFLD小鼠在游泳运动12周后，甘油酯类、甘油磷脂类和鞘脂类脂质表达谱均发生了明显变化，表现为TG含量减少，PC和PE含量增加，Cer含量增加，提示游泳运动对小鼠肝脏脂质代谢紊乱有改善作用，具体体现为毒性脂质下调，具有调节脂质代谢作用的脂质上调。

综上，本研究基于脂质代谢组学技术发现，NAFLD小鼠肝脏甘油酯类（TG、DG等）、甘油磷脂类（PC、PE等）以及鞘脂类（Cer等）脂质化合物代谢紊乱，肝脂肪变性明显改善[9]，首次证明了游泳运动对NAFLD小鼠肝脏脂质代谢谱有改善作用。然而本研究未进一步验证差异脂质化合物的表达情况并探究其作用机制，下一步我们将验证差异脂质化合物表达情况，并调节TG/DG比值、PC/PE比值或者二氢神经酰胺/神经酰胺比值，观察NAFLD疾病进展情况，探究NAFLD的靶向干预措施。

参考文献:

[14]陈皓,窦琳,杨光,等.肝细胞脂性凋亡在NASH中的作用和机制研究[J].生命的化学,2020,40(10):1730-1737.

[29]鲁涛,曹梦舒,郑云,等.游泳运动预处理抑制钙蛋白酶活性减轻心肌细胞膜的缺血-再灌注损伤[J].空军军医大学学报,2022,43(2):48-52.

基金资助:国家博士创新人才支持计划(BX201700107);

文章来源:罗燕,邓平,陈梦妍,等.基于脂质组学探究游泳运动对NAFLD小鼠脂质代谢的改善作用[J].局解手术学杂志,2024,33(12):1027-1033.