肝脏缺血-再灌注损伤(IRI)是指肝脏缺血后的一段时间内，血流重新恢复，而组织器官功能无法迅速恢复正常，组织器官结构破坏，炎症反应加重，甚至出现严重功能障碍的现象。最新研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)样受体热蛋白结构域相关蛋白(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein，NLRP)3炎症小体在肝脏IRI中起重要作用，可以通过抑制炎症反应减轻肝脏IRI[1]。

炎症小体概念是由Martinon等[2]在2002年首次提出，是一种大分子多蛋白复合物，其分子量约700 kDa，由模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)、凋亡斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)及前体-半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(pro-caspase-1)组成。NOD样受体(NOD-like receptors，NLR)家族及AIM样受体(AIM-like receptor，ALR)家族是构成炎症小体主要的PRR，NLR家族主要由3个结构域组成：N末端效应结构域可分为半胱天冬酶募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)、pyrin结构域(pyrin domain，PYD)或杆状病毒凋亡抑制重复序列(baculovirus inhibitor of apoptosis repeat，BIR)结构域；中央为核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)；C末端由富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeat sequences，LRR)组成[3]。炎症小体能够识别损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)、病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及稳态相关分子模式(homeostasis-associated molecular patterns，HAMPs)。NLRP3炎症小体在肝脏IRI的病理生理机制中发着非常重要的作用，是介导炎症反应的主要成分。NLRP3炎症小体是目前研究最为广泛和深入的炎症小体，是炎症反应的核心，几乎涉及所有脏器。NLRP3炎症小体参与了多种疾病的发生、发展，在代谢疾病和癌症的发病机制中发挥双重作用。因此，NLRP3炎症小体活化机制和分子机制仍值得我们研究。

一、NLRP3炎症小体的概念

NLRP3炎症小体是一种高度聚合的丝状蛋白复合物，其分子量为115 kDa，在树突细胞、淋巴细胞及单核细胞等细胞中均有表达。NLRP3是由1个N端PYD、1个中央核苷酸结合和寡聚化结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NACHT)、1个C端LRR所组成[4]。NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC及pro-Caspase-1三部分组成。当NLRP3炎症小体被激活后其结构也随之发生变化，活化的NLRP3炎症小体具有调节多种促炎因子的功能，从而参与炎症反应。

二、NLRP3炎症小体的激活

由于NLRP3炎症小体可以被多种激动剂所激活，激动剂分为PAMPs和DAMPs两类，前者包含病毒RNA、微生物毒素及细菌表面成分；后者包括尿酸结晶、ATP、铝佐剂、β-淀粉样肽等，激活机制非常复杂。Swanson等[5]指出，NLRP3炎症小体的激活方式包括3种：经典NLRP3炎症小体激活、非经典NLRP3炎症小体激活，以及替代NLRP3炎症小体激活。

1.经典NLRP3炎症小体激活：

经典NLRP3炎症小体的激活过程分为启动、激活两步。在启动步骤中，Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)、细胞因子受体、NLR可以诱导转录因子NF-κB的激活并促进NLRP3和pro-IL-1β的表达。除此以外，启动环节还可以调节NLRP3翻译后修饰(post-translational modification，PTM)。带有JAMM结构域的Zn2+金属蛋白酶(BRCA1/BRCA2 containing complex subunit 3，BRCC3)是一种去泛素化酶，它的作用是在起始过程中诱导NLRP3去泛素化，同时促进NLRP3炎症小体的激活[6]。因此，启动步骤对于NLRP3通过转录调控及PTM实现炎症小体的激活有重要意义。激活步骤包括激动剂的识别、组装和激活。与只能识别一种或几种结构相似的激动剂PRR相比，NLRP3可被多种不相关的PAMPs和DAMPs所激活。多种上游信号通过激活NLRP3诱导炎症小体的形成，已被证实的上游信号主要有离子通道的异常开放(如K+外流)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、溶酶体破坏、线粒体功能障碍等。在遇到刺激后，NLRP3通过同型NACHT结构域之间的互相作用寡聚，寡聚后的NLRP3再通过同型PYD-PYD之间的相互作用招募ASC，由多个ASC相互汇聚形成ASC斑点，组装好的ASC再通过CARD-CARD的相互作用招募pro-caspase-1，形成完整的NLRP3炎症小体。NLRP3炎症小体通过剪切活化caspase-1，然后再切割pro-IL-1β、pro-IL-18成为有活性的促炎因子IL-1β、IL-18，最后从细胞中释放出来，介导炎症反应并加重组织IRI[7]。

2.非经典NLRP3炎性体激活：

Kayagaki等[8]指出非经典的NLRP3炎症小体信号通路包括小鼠细胞中caspase-11(人类中的caspase-4和caspase-5)。小鼠细胞中非经典炎症小体的激活中启动信号的作用举足轻重。在此步骤中，转录因子NF-κB的激活和Ⅰ型干扰素的产生有赖于TLRs和细胞因子受体的配体诱导，从而通过调节JAK/STAT通路或补体C3-C3aR轴使得caspase-11高表达[9]。相反，在表达构成型caspase-4的人类细胞中，非经典的NLRP3炎症小体的激活不需要启动物[10]。此外，Ⅰ型干扰素还促进鸟苷酸结合蛋白(guanglate-binding protein，GBP)和干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein 10，IRGB10)的小干扰素诱导型鸟苷三磷酸酶(guosine triphosphatases，GTPases)簇的表达。感染革兰阴性菌后，IRGB10以GBP依赖性的方式直接指向靶细胞内细菌的细胞膜，从而破坏细菌结构完整性并将脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和脂质A释放到细胞质中[11]。Shi等[10]指出LPS和脂质A与小鼠细胞中caspase-11或人类caspase-4和caspase-5的CARD结构域相结合，导致半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶寡聚化和自身蛋白的水解。活化的caspase-4/5/11在Asp276处蛋白水解切割小鼠消皮素蛋白D(gasdermin D，GSDMD)并释放N-末端结构域(人的GSDMD为Asp275)，该结构域与质膜中的心磷脂、磷脂酰肌醇磷酸盐和磷脂酰丝氨酸结合并诱导孔形成，从而导致细胞凋亡，以及经典NLRP3炎症小体的激活。除G-外，自编码的氧化磷脂(1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine，OXPAPC)显示与鼠caspase-11和直系同源人类caspase-4结合并激活树突状细胞(dendritic cell，DC)中的非经典的NLRP3炎症小体。然而，有研究表明，OXPAPC通过与巨噬细胞中的caspase-11和LPS竞争性结合来抑制非经典NLRP3炎症小体，从而保护生物体免受感染性休克[12]。但OXPAPC对不同细胞中非经典NLRP3炎性体激活的机制还需要进一步研究。

3.替代NLRP3炎性体激活：

除经典和非经典NLRP3炎症小体激活途径以外，研究者还发现了替代的NLRP3炎症小体途径，单独的TLR配体不足以激活caspase-1或诱导成熟以及人和猪单核细胞中IL-1β的分泌也在该途径中被发现。此外，替代NLRP3炎症小体可通过NLRP3上游的TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8信号通路激活[13]。尽管替代的NLRP3-ASC-caspase-1信号通路对于NLRP3炎症小体的激活是必需的，但这一新的炎性小体既缺乏经典的NLRP3炎性小体激活，也缺乏非经典的NLRP3炎性小体激活，包括ASC点状突起的形成、细胞凋亡诱导或K+外流。最新研究表明，载脂蛋白C3(apolipoprotein C3，ApoC3)能够激活人单核细胞中caspase-8依赖性替代NLRP3炎症小体。通过TLR-SCIMP-Lyn-Syk-TRPM2轴，ApoC3与Tlr2和Tlr4相互作用，诱导它们产生异质二聚体，进而促进Ca2+流入、ROS生成、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶和caspase-8活化[14]。caspase-8是激活替代NLRP3炎症小体上游重要的分子，但其具体机制仍尚不清楚。因此，NLRP3和caspase-8在替代NLRP3炎症小体激活中的复杂机制需更深入研究。

三、NLRP3在肝脏IRI中的作用

肝脏IRI是指肝脏组织缺血一段时间后血流重新恢复却导致损伤加重的现象。肝脏IRI分为热IRI和冷IRI两种类型，热IRI损伤肝实质细胞，冷IRI损伤肝窦内皮细胞(hepatic sinusoidal endothelial cell，LSEC)和引起微循环障碍。虽然冷IRI、热IRI具有不同的细胞损伤类型，但其病理生理机制非常相似。研究表明，再灌注损伤诱发炎性小体的激活和炎性细胞浸润，通过抑制炎症小体的激活可以改善肝脏IRI。

1.ROS上调NEK7促进NLRP3炎症小体激活加重肝脏IRI：

相关研究表明，肝脏IRI发生的三大关键因素包括ROS、炎症级联反应和肝细胞凋亡。ROS作为代谢物质并参与人体的调节，具有维持细胞稳定的功能。然而，不同浓度的ROS却有悬殊的作用，低浓度的ROS可以促进免疫系统信号通路的激活，从而维持机体的免疫功能，高浓度ROS却能够激活细胞死亡途径[13]。Katwal等[15]指出在肝脏IRI中高浓度ROS可以破坏DNA、脂质和蛋白质分子，从而导致组织发生炎症、凋亡及坏死。有研究指出，过量的ROS是引起肝脏IRI的关键因素，此外，抑制miR-34a可以减弱ROS的产生，进而缓解肝脏IRI[16]。NIMA相关激酶(NIMA-related kinase，NEK)家族的重要成员NEK7作为重要的蛋白质，NEK7在钾外流的下游发生作用，介导NLRP3炎症体的激活以及组装，在NLRP3炎症小体的活化过程中，pro-IL-18、NLRP3、和pro-IL-1β的表达是由ROS通过NF-κB信号通路所调控的，作为NLRP3炎症小体活化过程中的关键分子，ROS位于NEK7上游[17]。ROS通过上调NEK7，从而激活NLRP3炎症小体，并促进炎性因子释放，包括IL-1β和IL-18，而NEK7不改变NLRP3的蛋白表达，它只是参与了NLRP3炎症小体激活，而且NEK7也无法改变细胞内ROS的表达。ROS是通过上调NEK7，从而进一步激活NLRP3炎症小体，导致肝脏IRI。

2.LKB1通过FoxO1抑制NLRP3减轻肝IRI：

肝脏激酶B1(liver kinase B1，LKB1)在 黑斑息肉综合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)被首次提出，其作为一种肿瘤抑制分子，在细胞生长代谢活动中意义重大[18]。有研究发现，LKB1可抑制NF-κB的激活从而减轻由LPS介导的炎症反应[19]。LKB1作为非常重要的炎症抑制分子参与多种细胞活动，并发挥重要作用。此外，LKB1通过调节下游的叉头蛋白O1(fork head box protein O1，FoxO1)的表达，从而参与NLRP3对肝脏IRI的影响。相关文献报道，LKB1可显著减轻小鼠肝脏IRI，并减少IL-1β、TNF-α等的释放，也使得NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1的蛋白水平降低。上调FoxO1的水平可以降低肝损伤，同时减少肝细胞死亡情况[20]。因此，LKB1通过上调进而影响FoxO1的活性而抑制NLRP3减轻小鼠肝IRI介导的炎症反应，此外，这种调节方式对肝脏组织具有保护作用。因此，LKB1通过下调FoxO1进而激活NLRP3炎症小体导致肝脏IRI。

3.CMPK2通过NLRP3信号通路促进肝脏IRI：

胞苷单磷酸激酶2(cytidine monophosphate kinase 2，CMPK2)是一种线粒体核苷酸单磷酸激酶，参与单核/巨噬细胞的终末分化、巨噬细胞激活和炎症反应[21]。此外，CMPK2具有强大的抗病毒和抗菌作用，CMPK2还可以通过NLRP3通路加重肝脏IRI。研究表明，CMPK2缺乏可降低小鼠血清ALT和AST表达，以及肝脏的病理变化。更重要的是，CMPK2降低抑制IL-18和IL-1β的释放，从而减轻肝脏IRI。Luo等[22]指出CMPK2基因敲除可抑制NLRP3炎性小体而降低caspase-1、IL-18和IL-1β的表达水平，但不改变NLRP3和前IL-1β的表达水平。因此，CMPK2通过NLRP3信号通路加速肝脏IRI，为肝脏IRI提供一种潜在的治疗策略。

4.SET8通过抑制MARK4/NLRP3炎症小体通路减轻小鼠肝脏IRI：

赖氨酸甲基转移酶SET8(SET domain-containing protein 8，Set8)是一种有效的蛋白，在细胞周期、DNA修复、炎症反应中发挥重要作用[23]。Set8和微管亲和调节激酶4(microtubule-affinity regulating kinase 4，Mark4)被认为是肝脏IRI时NLRP3炎性小体激活的关键调节因子。研究表明，Set8是Mark4/NLRP3炎性小体途径的上游调节因子，在诱导肝脏IRI中发挥重要作用。Luo等[24]指出小鼠肝脏IRI后，Set8表达降低，而Mark4表达升高，并且NLRP3 mRNA表达、血清IL-1β和IL-18水平也升高。Set8缺乏可有效促进NLRP3炎性小体的激活，表现为IL-18和IL-1β的产生增加，从而加重肝脏IRI，此外，Set8缺陷上调了Mark4的表达，并促进了NLRP3炎性小体的激活，而Mark4缺陷可以逆转这种损伤。因此，SET8通过抑制Mark4/ NLRP3炎症小体通路，负性调节肝脏IRI介导的炎症反应，从而减轻肝脏IRI。靶向调控Set8或Mark4，下调NLRP3炎性小体的激活，从而为治疗肝脏IRI提供新的策略。

5.SIRT1通过miR-182介导的XBP1/NLRP3通路减轻肝IRI：

沉默调节蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1)是一种NAD+依赖性的蛋白去乙酰化酶，参与细胞应激反应和免疫反应[25]。SIRT1激活是影响炎症反应和抑制肝脏IRI的媒介。SIRT1激活通过限制NLRP3炎症体的形成和IL-1β的产生来抑制细胞的炎症。肝脏X-盒结合蛋白1(X-box-binding protein1，XBP1)的表达与肝脏对内质网压力的适应性反应有关，导致肝脏损伤、肝细胞凋亡和肝纤维化的控制。Li等[26]研究表明SIRT1敲除后，XBP1、NLRP3、caspase-1、NF-kB、IL-1β、TNF-α和IL-18表达增加，进而激活XBP1/NLRP3炎症通路。此外，发现小鼠血清中的ALT明显增加，肝脏充血、空泡和坏死均明显增加，说明SIRT1敲除加重小鼠肝脏IRI损伤。Wang等[27]指出miR-182是SIRT1的下游效应器，SIRT1与miR-182启动子结合并调控其转录。研究表明，SIRT1正向调节miR-182的表达，而miR-182被发现在肝脏IRI小鼠中抑制XBP1的表达。miR-182-5p过表达导致TNF-a和IL-6减少，从而通过负向调节TLR4来减轻肝脏IRI[28]。因此，SIRT1通过调节miR-182介导的XBP1/NLRP3信号通路，从而减轻肝脏IRI。

6.Jagged1通过Notch1信号激活HSF1/Snail影响NLRP3炎症小体的活性调节肝脏IRI：

Notch信号控制先天免疫细胞的动态平衡和功能，是人类肝脏疾病中最频繁激活的信号通路之一[29]。由于Notch信号调节多种细胞活动，Notch级联的解除调控被发现在许多病理过程中起作用。Jagged1蛋白(Jagged1，JAG1)是Notch的配体之一，控制细胞发育所必需的。相关文献报道，热休克转录因子(heat shock factor 1，HSF1)作为细胞对热和其他各种应激源反应的主要转录调节因子，Notch1及Hes1可以通过抑制反馈环和转录调节来抑制炎症反应[30]。Snail转录因子在细胞发育、分化、炎症的调节中发挥重要作用[31]。JAG1介导的Notch1信号或HSF1诱导激活了Snail，这是控制细胞运动和生存的关键基因，而CRISPR/Cas9介导的HSF1基因敲除抑制了Snail，同时增加了NLRP3和炎症细胞因子的表达。Jin等[32]指出用JAG1处理的Notch1FL/FL小鼠表现出HSF1水平的增加，而Notch1M-KO小鼠表现出抑制HSF1的表达，表明JAG1介导的Notch1信号介导了HSF1的激活，同样得出JAG1介导的髓系Notch1信号激活了HSF1和Snail，进而抑制了NLRP3的激活，从而肝脏IRI。因此，Jagged1通过Notch1信号通路调节NLRP3炎小症体的激活，进而调节肝脏IRI。

7.抑制ATP6V0D2通过非依赖Notch1/Hes1的自噬通量促进NLRP3活化来加重肝脏IRI：

自噬参与免疫级联中各种细胞的免疫调节，已被证明与激活NLRP3炎性小体有多种串扰机制[33]。液泡ATP酶(vacuolar ATPase，V-ATPase)作为一种电质子泵，其主要功能区由V1和V0组成。ATP6V0D2亚基(V-ATPase D2)可在体外可促进自噬溶酶体的形成[34]。在肝脏IRI中，IR诱导自噬激活可以清除受损的线粒体和ROS，增加能量供应，从而减少肝脏损伤。Wang等[35]指出肝缺血术后肝巨噬细胞中特异性ATP6V0D2的表达随着炎症级联反应的诱导而上调，ATP6V0D2的敲除导致促炎因子和趋化因子的分泌增加，从而促进NLRP3的激活，加重肝损伤。进一步研究发现，NLRP3的激活加剧与ATP6V0D2调节的自噬通量有关。敲除ATP6V0D2可通过非特异性激活非特异性V-ATPase-Notchl-Hesl信号轴，抑制自噬溶酶体的形成，加重肝脏IRI。因此，ATP6V0D2主要通过诱导自噬溶酶体的形成来减轻肝脏IRI。

8.EVA1A抑制NLRP3的激活诱导Kupffer细胞的自噬作用减轻肝脏IRI：

自噬就是通过溶酶体依赖的途径，将已经受损的细胞器和蛋白质降解，并将它们转化为能量，从而促进细胞的生存，这个过程是高度保守的。EVA-1同源基因A(Eva-1 homologous gene A，EVA1A)是一种溶酶体和内质网相关蛋白，已有研究证实它在调节自噬和细胞凋亡等方面的作用[36]。EVA1A的缺失可以通过损害自噬而加重肝损伤。Kupffer是巨噬细胞的一种，沿着肝脏血管的窦状曲线存在，其约占肝脏非血浆细胞的35%，占全身组织巨噬细胞的80%～90%。Wang等[37]在相关文献中报道，增强Kupffer细胞的自噬作用可以抑制缺血引起的NLRP3激活，抑制自噬可以诱导依赖NLRP3激活的IL-1β分泌；而EVA1A在体内的敲除一方面会加重IR的炎症反应，增加TNF-α、IL-1β的产生，抑制IL-10的分泌，另一方面会加重肝脏的组织损伤。此外，在敲除EVA1A基因后，caspase1和IL-1β以NLRP3依赖的方式被激活和切割，从而加重肝脏IRI，这与阻断EVA1A促进自噬小体形成的功能密切相关。因此，EVA1A调节自噬途径进而影响NLRP3炎症小体的激活及肝脏IRI。

此外，其他分子机制也陆续被发现。Vargas和Videla[38]发现经过甲状腺激素(thyroid hormone，T3)预处理，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)的活性将被提高，从而抑制NLRP3炎症小体的激活来缓解肝脏IRI。然而，使用AMPK抑制剂化合物C可破坏这种保护现象。El-Sisi等[39]指出，奥曲肽(octreotide，OCT)和褪黑素(melatonin，MLT)通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路从而减轻肝脏组织的损伤，使得肝脏IRI明显被抑制。应用OCT 75μg/kg的处理可抑制TLR4、NF-κB和NLRP3炎症小体的表达，显著降低血清ALT和AST含量及其肝脏IRI。Inoue等[40]表示，在肝脏IRI发生后，NLRP3 mRNA的表达显著增加，NLRP3蛋白缺失可减小肝组织受损区域、血清ALT水平以及炎症因子的分泌。此外，NLRP3缺失降低了损伤区域氧化物的表达和凋亡细胞的数量，NLRP3缺失也会损害中性粒细胞的迁移活性。Kamo等[41]指出在肝脏IRI中ASC/caspase-1/IL-1β信号通路通过触发高迁移率族蛋白1(high mobility groupprotein1，HMGB1)诱导产生炎症反应，ASC蛋白缺失抑制了caspase-1/IL-1β的信号传导通路，减轻肝脏IRI并提高抗凋亡能力。Huang等[42]指出NLRP3炎症小体可被内源性组蛋白激活，通过激活caspase-1增加IL-1β和IL-18的产生进而加重肝脏IRI。Zhong等[43]表示干扰素基因刺激物(stimulator of interferon genes，STING)通过STING/NLRP3信号轴促进肝脏IRI和炎症反应，抑制STING的含量，可降低肝脏IRI中炎症因子和趋化因子的释放，从而降低肝脏IRI。

四、总结与展望

综上所述，NLRP3炎症小体是目前已知范围内研究最多且最广泛的炎症小体。在肝脏IRI中，NLRP3介导的炎症反应可延长组织器官恢复时间，进而加重组织器官的损伤。因此，可通过抑制NLRP3介导的炎症反应，减轻炎症反应所带来的组织器官的损伤从而治疗肝脏IRI，此外，抑制NLRP3的激活是预防肝脏IRI的另一种方案。然而，NLRP3炎症小体在肝脏IRI中激活的分子机制尚不完全清楚，未来应进一步明确，为临床肝脏IRI的治疗提供新的思路。最后，NLRP3炎症小体激活及其在肝脏IRI中的机制仍值得我们深入研究。

基金资助:国家自然科学基金(82260411,82270632);新疆维吾尔自治区科技厅重点实验室开放课题(2018D04002);

文章来源:张云飞,吐尔洪江·吐逊.NLRP3炎症小体及其在肝脏缺血-再灌注损伤中的作用机制[J].中华肝脏外科手术学电子杂志,2024,13(03):398-403.