随着我国人民生活水平的不断提高，饮酒率也持续升高，使得酒精性肝病的发病率逐年增加[1]。人体在长期或短期内大量摄入酒精会引起酒精性肝损伤(Alcoholic liver injury,ALI)，目前对发生ALI的病人主要采取戒酒、营养支持和皮质激素类药物治疗，但疗效有限，且长期使用药物会导致肝脏的二次损伤。除此之外，许多中药材也有解酒护肝的功效，由于其低毒性、多靶点且作用温和被广泛应用，因此选用中草药可成为临床治疗ALI更有效的预防和治疗方法。

藤梨根是中华猕猴桃(Actinidia chinensis Planch.)的根，猕猴桃科猕猴桃属植物[2]，其根部作为一种中药，具有多种药理作用。已分离鉴定的化学成分大于90种，主要包括三萜类、黄酮类、蒽醌类、甾体及其苷类、生物碱类、酚酸类、糖类、氨基酸、挥发油、无机金属元素以及其他类[3,4]，气味清淡、味偏苦涩，性味平和[5]。《本草纲目》记载藤梨根具有清热邪、解热毒，活血化瘀，祛风消炎等功效，我国民间多用其根茎煎煮熬水治疗肝脏疾病、肿瘤、疮疖等，但具体疗效及其机制尚不明确[6]。国内外研究表明藤梨根在治疗胃癌、肝癌、肠癌、肺癌、食管癌等肿瘤中疗效显著[7,8,9]，具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂、提高免疫力等功效[10,11,12]。肖素军等人研究发现猕猴桃根多糖对角叉菜胶诱导的小鼠血栓形成具有一定的抑制作用，这可能与其抑制凝血途径有关[13]，但是其对ALI的作用方面的研究鲜有报道。

本文通过超声法提取藤梨根多糖，通过构建小鼠酒精性肝损伤动物模型，探究藤梨根多糖对小鼠酒精性肝损伤的作用，为藤梨根的开发利用提供实验依据，并为酒精性肝损伤的治疗及预防提供理论基础。

1、实验材料

1.1实验动物

SPF级昆明小鼠60只，雄性，体重22～25 g，生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，购于湖南斯莱克景达实验有限公司，适应性喂养7天后进行实验。

1.2材料与试剂

藤梨根(批号20211003，产地湖南湘西)，经湘南学院王岐本教授鉴定为正品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD，批号20211111)、丙二醛(MDA，批号20211016)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α，批号20211028)、还原型谷胱甘肽(glutathione peroxidase,GSH，批号20211009)、白介素-6(interleukin-6,IL-6，批号20211012)试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；多烯磷脂酰胆碱胶囊(批号ABJD399B)，购自赛诺菲(北京)制药有限公司；56°红星二锅头酒，产自北京红星股份有限公司；无水乙醇为分析纯，购自湖南汇虹试剂有限公司。

1.3仪器设备

旋转蒸发仪(RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂)，恒温水浴箱(HH-2，湖南力辰科技有限公司)，台式高速冷冻离心机(LC-LX-H165A，湖南力辰)，SpectraMax iD3多功能酶标仪(Molecular Devices)，超声波清洗机(KQ-800DE，昆山舒美超声仪器有限公司)。

2、方法

2.1藤梨根多糖的制备

藤梨根切片用超声提取法提取多糖[14]。藤梨根饮片中加4倍量水，温度80℃下超声提取60分钟，收集提取液后再加入4倍量的水超声提取30分钟，收集并合并提取液，静置24小时后取上清液，将95%的乙醇加入上清液并使其乙醇含量达到70%。静置24小时后，弃上清，向沉淀物中加入95%的乙醇，自然沉淀后，取沉淀物。首先用75%乙醇对沉淀物进行洗涤，其次用无水乙醇，然后用丙酮，最后用无水乙醚依次充分洗涤，并用Sevage法去除蛋白，活性炭进行脱色处理后得到粗多糖，再用透析袋透析多余成分，冷冻干燥，于-20℃冰箱储藏。

2.2小鼠酒精性肝损伤模型制备

将60只小鼠随机分为模型组、空白对照组、阳性对照组、藤梨根多糖低浓度组、中浓度组和高浓度组，每组10只，适应性喂养一周，其中空白组及模型组小鼠每日上午定时灌胃生理盐水(0.1 mL/10 g)；阳性对照组灌胃多烯磷脂酰胆碱胶囊(195.4 mg/kg/d)；藤梨根多糖低、中、高浓度组将藤梨根多糖沉淀物用水加热溶解，分别配成1、2、4 mg/mL溶液，按0.1 mL/10 g的体积进行灌胃。6小时后给空白组小鼠灌胃生理盐水，其余各组灌胃56°红星二锅头酒，连续灌胃15天，整个实验过程中小鼠均正常饮食，每2天称量一次体重，并按体重变化调整灌胃剂量。最后一次处理后，所有小鼠禁食不禁水16小时，称重后进行眼眶取血，颈椎脱臼处死后取肝脏。

2.3血清生化指标测定

采用全自动生化分析仪测定血清中谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)含量。

2.4肝脏指数测定

将取出的肝脏放入预冷的生理盐水中冲洗，再用滤纸吸干其表面水分，并置于电子天平上称重，观察肝脏质地、颜色和大小，并计算肝指数(肝脏指数=肝脏重量/体重×100%)。

2.5生化指标测定

电子天平称取肝脏右叶0.1 g置于液氮下快速研磨后加入4℃预冷生理盐水，制成10%的肝脏组织匀浆，低温离心10 min(4℃，4000 r/min)后收集上清液，按照试剂盒说明书方法检测TNF-α、IL-6含量和MDA、GSH、SOD活力。

2.6肝组织病理学观察

取肝组织右叶上约2×2×2 mm体积的组织浸于10%甲醛固定液中，经过脱水、石蜡包埋后制约6μm厚的切片，并进行HE染色，显微镜下200倍观察各组小鼠肝脏组织形态变化。

2.7数据统计分析

所有数据以均数±标准偏差(±s)表示，通过SPSS 25.0软件进行统计分析，P<0.05表明数据之间差异有统计学意义，P<0.01说明数据之间存在极显著差异，P>0.05则代表无统计学意义。综合统计结果采用GraphPad Prism 5绘制图表。

3、实验结果

3.1藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠体重和肝指数的影响

表1藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠体重和肝指数的影响(±s,%)  

如表1所示，与空白对照组相比，模型组小鼠体重降低9.55%，空白对照组小鼠体重较模型组显著增高11.13%(P<0.05)，说明饮酒会导致体重降低。藤梨根多糖各剂量组与模型组相比，各剂量组小鼠体重增幅上升。模型组小鼠肝指数与空白对照组相比显著升高(P<0.01)。藤梨根多糖高剂量组肝指数与模型组相比显著降低21.8%(P<0.01)，由此表明，藤梨根多糖对肝指数的升高有抑制作用。

3.2藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠血清TG、TC浓度的影响

长期大量饮酒常伴随着血脂异常，酒精代谢过程会引起血症代谢紊乱，导致TC酯化不良和过多的TG生成，进而发展成为高甘油三酯血症和高胆固醇血症。实验中，我们比较了各组小鼠血清TG和TC浓度，发现模型组小鼠TG和TC均升高，与模型组相比，藤梨根多糖各浓度组血清TG和TC都有降低，并在中浓度和高浓度组有差异P<0.05(图1)，阳性药物显著降低了TC与TG水平。由此可见，藤梨根多糖可抑制酒精性肝损伤小鼠肝脏的脂质水平。

图1藤梨根多糖可降低酒精性肝损伤小鼠血清TG、TC浓度  

3.3藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST含量的影响

图2藤梨根多糖降低酒精性肝损伤小鼠血清AST (A)、ALT(B)含量  

肝细胞在发生损伤时其细胞膜通透性增加，使广泛存在于肝脏组织和心肌组织中的ALT、AST渗透到血液，这两种血清转氨酶作为非特异性功能酶，是评估肝损伤的重要指标。如图2结果可见，模型组血清中AST、ALT水平与空白对照组相比显著升高(P<0.01)，说明实验中小鼠酒精性肝损伤模型建立成功。藤梨根多糖不同浓度组与模型组比较，中浓度组和高浓度组AST和ALT水平均显著降低，中浓度组分别降低32.27%和20.47%(P<0.01)，高浓度组分别降低26.61%和28%(P<0.01)，结果表明，藤梨根多糖具有缓解酒精性肝损伤的作用。

3.4藤梨根多糖对小鼠肝脏MDA、GSH和SOD的影响

MDA作为多种不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，是氧化应激的标志。GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶，GSH-Px活力的高低反映了机体清除自由基能力。我们通过检测小鼠肝脏中MDA、GSH-Px和SOD含量了解藤梨根多糖的抗氧化活性。

如图3所示，模型组小鼠肝脏中SOD和GSH水平与对照组相比明显降低(P<0.01)，而MDA水平显著升高(P<0.01)，可见饮酒引发了体内的氧化应激反应。与模型组相比，藤梨根多糖中浓度组SOD水平升高了25.77%(P<0.05)，高浓度组SOD升高了30.29%(P<0.01),GSH-Px升高了28.75%(P<0.05),MDA降低了30.61%(P<0.05)。由此可见，藤梨根多糖能降低MDA含量，增强SOD和GSH-Px活性，说明了该药物缓解了小鼠体内脂质过氧化反应，藤梨根多糖对缓解酒精诱导的氧化应激具有潜在的作用。

图3藤梨根多糖升高了酒精性肝损伤小鼠肝脏SOD(A)、GSH-Px(C)水平，降低了MDA(B)水平  

3.5藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠肝脏TNF-α和IL-6的影响

炎症性损伤是酒精性肝损伤的一个主要特征。在临床中发现，发生ALI的患者其IL-6以及TNF-α含量较正常人普遍升高。为了研究藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠炎症反应的影响，本实验中检测了小鼠肝脏TNF-α和IL-6的水平。

模型组与空白对照组相比，小鼠肝脏TNF-α和IL-6显著升高(P<0.01)，说明饮酒引起小鼠体内的炎症反应。相比模型组，给予了藤梨根多糖处理的小鼠体内TNF-α和IL-6水平明显减低，中浓度组中IL-6降低了23.56%(P<0.05)，高浓度组中TNF-α水平降低了49.48%(P<0.05),IL-6降低了28.71%(P<0.01)(图4)。由结果可见，藤梨根多糖对酒精诱发的肝损伤的炎症反应有缓解作用。

图4藤梨根多糖影响酒精性肝损伤小鼠肝脏TNF-α(A)和IL-6(B)水平

3.6藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织形态的影响

由图5可见，空白组小鼠肝细胞形态清晰、结构完整，围绕中央静脉呈放射状排列，未见坏死、炎症浸润及明显的细胞变性(图5-A)；模型组肝细胞细胞核萎缩，出现脂肪空泡，形态不规则，有炎症细胞浸润，可见明显损伤(图5-B)。与模型组相比，藤梨根多糖中剂量组和高剂量组坏死细胞数量减少，肝细胞中可见微泡型脂肪化生，可见轻微淋巴细胞浸润、灶状坏死，存在一定的剂量效应(图5-E,5-F)。

图5藤梨根多糖对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织形态的影响(H&E:200×)  

4、讨论

肝脏是持续饮酒的主要靶器官，饮酒后酒精会在肝脏中进行代谢，长期大量饮酒会导致肝脏的慢性中毒，引发酒精性肝损伤(alcoholic liver injure,ALI),ALI的发病机制目前尚不明确，氧化应激、细胞凋亡、细胞因子、内毒素(LPS)、遗传多态性、转录因子及micro RNA等方面的影响对酒精性肝损伤患者起着关键作用[15,16]。早期主要表现为酒精性脂肪肝，随着病情的加重会发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌。除此之外，酒精性病还会引发许多并发症，如高脂血症、动脉粥样硬化、高血压等[17]。随着我国饮酒率的不断上升，酒精性肝损伤已成为我国的第二大肝损伤疾病。人在饮酒后，酒精通过血液循环进入肝脏，80%的酒精在肝脏进行代谢，其代谢物乙醛对肝脏有损伤作用，长期大量饮酒引起的肝损伤是引发肝脏疾病的非常重要的因素之一。

氧化应激和炎症反应在酒精性肝损伤发病机制中有主要作用。Sheng lei Yan等人的研究中表明发生ALI的主要原因之一是氧化应激，活性氧(reactive oxygen species,ROS)是酒精在机体代谢过程中不断产生主要产物[18,19]，抗氧化酶系统(如SOD和GSH-Px)会清除多余的ROS，当机体中ROS过多不能及时地被清除时，会激活可诱导细胞凋亡的TNF-α、IL1β、炎性细胞因子等产生[20,21]。进而引发脂质过氧化反应，导致血脂异常，进一步地引发肝细胞损伤[22]。

其乐木格等人对酒精性肝病动物模型的建立方法进行了比较，从急性、慢性和特殊方法3个方面总结归纳了国内外有关小鼠和大鼠ALI模型的制作方法以及各自的特点，急性酒精性肝损伤模型是在短时间内通过大剂量酒精诱发肝损伤，可很好地模拟人类在短时间内大量饮酒造成的肝损伤，该模型能引起肝脏轻微的脂肪变性，炎细胞浸润，伴轻度气球样变等病理改变，可用于酒精性肝损伤早期的研究[23]，其中急性酒精性肝损伤的造模主要通过灌胃和腹腔注射[24]，结合人类的饮酒习惯，且考虑到多次腹腔注射死亡率高且易引发肠管、脏器间粘连等因素，因此选用灌胃酒精的方法复制急性酒精性肝损伤模型。

研究表明，天然产物中的多糖具有抗氧化性，抗肿瘤、调节免疫力等作用，可通过抗氧化途径减轻酒精性肝损伤。酒精介导的氧化应激是导致肝脏损害的主要原因之一，本研究通过长期定时定量给小鼠灌胃红星二锅头酒复制出酒精性肝损伤模型，观察并分析了藤梨根多糖对酒精性肝损伤的保护作用。从实验结果看见，模型组小鼠经过长期饮酒，体重较空白组降低，并且模型组小鼠血清中AST、ALT水平显著升高，可说明模型复制成功。我们检测肝组织中SOD、MDA、GSH等活力来判断机体清除自由基的能力，通过检测肝脏中TNF-α和IL-6来判断其炎症反应程度。由实验结果可见，模型组小鼠肝脏中SOD和GSH水平明显降低，MDA水平显著升高，表明饮酒引发了体内的氧化应激反应。藤梨根多糖中剂量组和高浓度组SOD和GSH-Px水平均有升高，高浓度组上升得更明显，MDA水平降低。以上结果表明，藤梨根多糖对酒精性肝损伤有一定的保护作用，但具体机制还需进一步研究。

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基金资助:湖南省教育厅科学研究项目(21C072);湖南省大学生创新创业训练计划项目(3665);湘南学院校级大学生创新创业训练计划项目(2023,132);

文章来源:韩瑛,肖霞,盛文杰,等.藤梨根多糖对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J].广东化工,2024,51(12):175-178.