饮水型砷中毒是我国砷中毒的主要类型之一，我国西北、西南某些省份(如：内蒙古、山西等)均发生过饮水型砷中毒，饮水砷暴露也是世界范围的公共卫生问题[1,2]。长期的砷暴露会显著增加癌症的发生[3,4],导致人体甲状腺功能减退等[5]。但关于饮水型砷暴露对人群甲状腺损伤和机制研究较少，相关的动物实验和体外实验已经开始初步探索砷暴露对实验动物甲状腺的损伤作用及机制。本研究根据以往研究估计低砷暴露剂量下对实验动物甲状腺组织功能的影响，并寻找可能的作用机制。相关研究显示，砷极有可能是环境雌激素类物质，Derwahl等[6]认为，雌激素可通过经典基因组途径(雌激素受体)和非基因组途径[如：丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)通路等]两种方式发挥效应，通过结合雌激素受体促进甲状腺结节、甲状腺癌的增长和发展，如：促进甲状腺乳头状癌增殖和侵袭转移[7]。并且多数甲状腺乳头状癌患者雌激素、孕激素水平升高[8]。国内外研究显示砷暴露可导致鼠的甲状腺组织细胞核明显减少、滤泡结构破坏或崩解、胶质稀薄或缺少，甲状腺激素受体α(thyroid hormone receptorα, TRα)基因表达改变，诱导甲状腺功能减退[9]。当饮水砷暴露剂量约0.01～5 mg/kg时，砷暴露由动物器官组织器质性的损伤转变为对组织细胞的代谢、酶活力、基因表达、内分泌平衡、神经系统的影响，此时的砷暴露倾向于内分泌的干扰作用(如：雌激素效应)[10,11,12]。砷暴露可能通过雌激素效应途径对甲状腺造成损伤，而砷的雌激素效应在甲状腺病变发生中的作用机制值得探究。

1、材料与方法

1.1材料

本实验使用新疆医科大学动物实验中心提供清洁级Wistar大鼠，于SPF动物实验室雌雄分笼饲养20周。实验选取4周龄清洁级Wistar大鼠(60～100 g)70只，随机分为7组，每组10只，雌雄各半，分笼饲养。实验采取自由饮水方式，普通饲料喂养，每日12 h通风照明一次，室温20℃～25℃,湿度40%～60%。实验各组分别为：正常对照组、低砷组、中砷组、高砷组、低砷+干预组、中砷+干预组、高砷+干预组。砷染毒低、中、高剂量分别为0.8、4.0和20.0 mg/(kg·d),正常对照组饮用无菌水(0 mg/kg亚砷酸钠)。实验先适应性喂养1周，每周记录1次大鼠体重，每天监测大鼠饮水状况，一周换水2～3次。砷暴露第9周开始所有干预组通过尾静脉注射方式给予大鼠0.5 mg/kg雌激素受体抑制剂ICI182780,每周注射3次。染砷第19周末水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，经腹主动脉采集外周血并分装血清。甲状腺经大鼠颈部剥离并取材制作电镜切片。待测样本液氮暂存后转至-80℃冰箱备用。

1.2主要仪器与试剂

主要仪器：冷冻高速离心机(德国Sigma公司，型号3-18K),全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，型号Multiskan GO),实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，型号QuanStudio 6 Flex),透射电镜(日本JEOL公司， 型号JEM-1230),电泳仪(美国Bio-Rad公司， 型号043BR15000)等。

主要试剂：大鼠雌二醇(estradiol, E2)、总三碘甲状腺原氨酸(total triiodothyronine, TT3)、总甲状腺素(total thyroxine, TT4)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)ELISA试剂盒均为CUSABIO公司产品，TRα鼠抗、二抗(山羊抗兔)为北京博奥森公司试剂，cDNA逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒均为日本TaKaRa公司产品。引物由生工生物公司设计合成，见表1。

表1引物序列

1.3方法

1.3.1 ELISA法检测血清E2(pg/ml)、TT3(ng/ml)、TT4(ng/ml)、TSH(μIU/ml)含量，严格按说明书要求进行实验操作。

1.3.2实时荧光定量法(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测甲状腺组织雌激素受体α(estrogen receptorα, ERα)、TRα的mRNA相对表达量，实验过程均在冰上操作。RNA逆转录为cDNA后进行荧光定量PCR反应，并按表2所示PCR反应程序扩增GAPDH、ERα、TRα基因。以GAPDH基因为内参基因，运用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量，-ΔΔCt= -[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因) - (Ct对照组目的基因- Ct对照组内参基因)],见表2。

表2 RT-qPCR反应程序、

1.3.3蛋白免疫印迹法(western blot, WB)检测甲状腺组织TRα的蛋白表达水平，一抗稀释度：β-Tubulin 1∶5 000,TRα1∶1 000,二抗稀释度：1∶10 000。

1.3.4透射电镜法 观察大鼠甲状腺组织病理形态学结构改变。甲状腺组织离体1 min内，刀片切取同一部位约1 mm厚5 mm长的组织2～3片，立即使用2.5%戊二醛固定甲状腺组织，颠倒混匀使其完全浸泡于固定液中，4℃保存过夜后，送至电镜室，进行漂洗、后固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、切片等步骤后，再观察组织结构。

1.4统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据处理与统计学分析，计量资料用均值±标准差(x¯±s)进行描述，数据进行Shapiro-Wilk正态性检验与方差齐性检验(F-test),数据不满足正态性则进行对数转换，符合正态性后，同性别各组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐时两两比较采用最小显著差法(LSD检验),方差不齐时方差分析为Welch检验分析值，两两比较采用Games-Howell检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1大鼠一般状况

大鼠饲养20周期间，各组体重增长趋势基本一致，体重变化基本正常。砷暴露后及干预剂注射后各组体重平缓上升，未出现骤降现象。经分析，染毒前雌雄大鼠各组平均体重差异均无统计学意义(P=0.940)。染毒后及干预后，雌雄各干预组与同剂量砷暴露组间比较平均体重差异均无统计学意义(P>0.05),说明干预措施与染毒状况均较好。见图1、图2。

图1雌性大鼠饲养20周各组平均体重变化

图2雄性大鼠饲养20周各组平均体重变化

2.2大鼠E2及ERα表达情况

2.2.1血清E2表达情况

雌性大鼠各组间E2表达水平差异有统计学意义(F=23.154,P=0.000)。雌性低砷组[(158.83±11.03)pg/ml]、中砷组[(127.28±14.13)pg/ml]、高砷组[(113.36±4.12)pg/ml ]的E2表达高于对照组[(93.01±1.65)pg/ml](P=0.000,0.001,0.031),低砷组E2表达高于中砷组、高砷组(P=0.002,0.000),低砷+干预组[(87.77±8.29)pg/ml]、中砷+干预组[(107.30±16.69)pg/ml]、高砷+干预组[(70.94±8.14)pg/ml ]的E2表达水平较同剂量砷暴露组下降(P=0.000,0.034,0.000)。雄性大鼠各组间E2表达水平差异无统计学意义(F=1.588,P=0.223)。见图3。

图3各组大鼠血清E2表达情况(pg/ml, x¯±s)(n=5)

2.2.2甲状腺ERα基因表达水平

雌性(F=385.235, P=0.000)和雄性(Welch检验F=513.694, P=0.000)大鼠ERα相对表达量各组间比较差异有统计学意义。雌性低砷组(0.43±0.02)、中砷组(0.66±0.04)、高砷组(0.33±0.02)ERα相对表达量低于对照组(1.00±0.04),低砷组高于高砷组；雄性低砷组(0.26±0.02)ERα相对表达量低于对照组(1.00±0.04)、中砷组(0.91±0.03)、高砷组(0.44±0.02);雌性和雄性大鼠低砷+干预组(2.71±0.09;1.88±0.07)较低砷组、高砷+干预组(1.36±0.20;1.03±0.02)较高砷组ERα相对表达量均上升(均P=0.000)。见图4。

图4各组大鼠甲状腺ERα基因表达情况(x¯±s)(n=5)

2.3大鼠甲状腺功能指标(TT3、TT4、TSH)及TRα表达情况

2.3.1血清TT3、TT4、TSH表达水平

雌性大鼠TT3(F=20.558, P=0.000)、TT4(F=8.977, P=0.000)、TSH(Welch检验F=11 995.868, P=0.000)表达水平和雄性大鼠TT3(Welch检验F=46.769, P=0.000)、TT4(F=5.421, P=0.004)、TSH(Welch检验F=307.291, P=0.000)表达水平各组间比较差异均有统计学意义。雌性大鼠高砷组TT3[(0.81±0.03)ng/ml]和TSH[(11.17±0.13)μIU/ml]表达高于对照组[(0.75±0.01)ng/ml]和[(1.06±0.06)μIU/ml]、低砷组[(0.74±0.03)ng/ml]和[(0.40±0.00)μIU/ml]、中砷组[(0.77±0.01)ng/ml]和[(0.55±0.05)μIU/ml](P=0.003,0.001;0.001,0.000;0.018,0.003);雌性高砷组TT4[(23.90±0.59)ng/ml]表达水平低于对照组[(25.71±2.03)ng/ml]、低砷组[(26.70±1.18)ng/ml]、中砷组[(27.04±0.34)ng/ml](P=0.033,0.003,0.001)。雌性高砷+干预组TT3[(0.73±0.00)ng/ml]、TSH[(0.83±0.01)μIU/ml]表达水平较高砷组[(0.81±0.03)ng/ml]和[11.17±0.13)μIU/ml]下降(均P=0.000)。雌性低砷组、中砷组TSH表达水平低于对照组(P=0.002,0.018),低砷+干预组较低砷组，中砷+干预组较中砷组均上升(P=0.000,0.008)。雄性低砷组、中砷组、高砷组TSH表达水平均低于对照组(P=0.031,0.029,0.004),低砷+干预组较低砷组，中砷+干预组较中砷组，高砷+干预组较高砷组TSH表达均上升(P=0.010,0.001,0.017)。见图5。

图5各组大鼠血清TT3、TT4、TSH表达情况(x¯±s)(n=5)

2.3.2大鼠甲状腺TRα基因与蛋白表达情况

雌性(Welch检验F=822.249, P=0.000; F=18.490, P=0.000)和雄性(F=60.310, P=0.000; F=39.317, P=0.000)大鼠TRα基因和蛋白表达水平各组间比较差异均有统计学意义。雌性中砷组(1.26±0.04, 1.25±0.03)、高砷组(1.29±0.04, 1.53±0.10)基因和蛋白表达水平较对照组(1.01±0.04, 1.02±0.13)均上升(P=0.004, 0.022;0.002, 0.000),高砷+干预组(0.43±0.08, 0.79±0.16)较高砷组基因和蛋白水平均下降(均P=0.000);雄性中砷组(0.60±0.14, 0.84±0.01)、高砷组(0.43±0.05, 0.67±0.06)基因和蛋白表达水平较对照组(1.00±0.03, 0.96±0.02)下降(P=0.000,0.001;0.000, 0.000),高砷+干预组(1.40±0.12, 0.79±0.02)较高砷组基因与蛋白水平均上升(P=0.000,0.001)。雌性(0.77±0.02)和雄性(0.43±0.15)大鼠低砷组TRα基因表达水平较对照组(1.01±0.04, 1.00±0.03)均下降(P=0.017,0.000),雌性和雄性低砷干预组(1.66±0.02, 1.16±0.15)较低砷组(0.77±0.02, 0.43±0.15)TRα基因表达水平均上升(均P=0.000)。见图6、图7。

图6各组大鼠甲状腺TRα基因表达情况(x¯±s)(n=5)

图7各组大鼠甲状腺TRα蛋白表达情况

2.4大鼠甲状腺组织形态学改变

各组大鼠甲状腺组织形态学结构总结如下：正常对照组甲状腺腺上皮细胞完整，细胞膜界线清晰，细胞内清晰可见各类细胞器，核形态规则，粗面内质网形态结构完整，线粒体可见清晰的线粒体嵴，细胞内有大量分泌颗粒。大鼠砷暴露后，甲状腺腺上皮细胞细胞膜、细胞核、线粒体、内质网、游离面微绒毛均有不同程度的形态结构异常改变。低剂量砷暴露细胞基质密度改变，核外形不规则、核膜凹陷、核周隙节段性增宽、核仁较大，内质网轻微肿胀呈泡状出现脱颗粒现象，线粒体明显水肿、嵴明显溶解、可见少量空泡变性。高剂量砷暴露腺上皮细胞失去明显形态，胞内可见各细胞器分布杂乱；胞质明显水肿呈空泡变性，细胞核异形、核膜凹陷、可见较深切迹，核体积变小，线粒体嵴轻微溶解、形态不规则，内质网溶解失去板层结构、有明显脱颗粒现象，亦可见形态不规则扭曲、空泡变性水肿，及髓样小体；分泌颗粒变形，吞噬溶酶体，出现自噬现象。见图8。

图8大鼠甲状腺组织结构电镜结果

3、讨论

本研究大鼠染砷结果显示，低砷组雌性大鼠血清E2水平上升幅度最大和ERα基因表达水平较对照组下降(P<0.05),说明低砷暴露对雌性大鼠产生了明显的雌激素效应，其作用方式可能是砷和E2竞争性地与ERα结合，抑制了雌激素与ERα结合的发生，使游离性E2增多。有关研究结果同样表明，大鼠砷暴露后可能引发雌激素效应，使ERα水平下降及E2表达改变，认为砷是一种环境雌激素类物质，亚砷酸钠可能以类似17β-E2的作用方式激活细胞ERα[6,13,14]。本研究电镜结果显示，即使是低剂量的砷暴露也可使大鼠甲状腺组织滤泡上皮细胞结构发生改变(胞内水肿、胞膜局部破裂、线粒体水肿等);低砷组甲状腺功能指标TT3、TT4、TSH表达水平和ERα、TRα基因表达量呈现出整体的下降趋势，有关研究认为砷暴露可对甲状腺内分泌系统(甲状腺-下丘脑-垂体)造成毒性而影响甲状腺激素的合成、分泌、运输、代谢和调节[14],说明长期慢性的砷暴露可能已经干扰大鼠垂体和下丘脑功能，影响其不能分泌足够的TSH,抑制甲状腺分泌甲状腺激素引起甲状腺功能减退。

有关研究强调，癌细胞中TRα的基因表达量远高于正常组织[15],细胞核增大、分叶核、核沟、线粒体形态大小异常等结构改变对甲状腺乳头状癌的诊断有重要的参考价值[16,17,18]。本研究中，雌性高砷组TSH水平的异常升高和TT4水平降低(P<0.05)是甲状腺功能受损后激素水平异常改变的情况，同时雌性高砷组TRα基因表达较对照组上升，结合本组甲状腺组织电镜形态学结构的改变(巨大核、核深切迹、核膜凹陷折叠、线粒体形态扭曲、自噬小体等),认为TRα可能是砷暴露致雌激素效应后甲状腺组织损伤和癌变发展的重要作用靶点。

相关研究表明，砷也可能通过雌激素水平的升高和介导雌激素受体促进甲状腺癌的发生和增殖，TRα和β基因表达的改变可能是砷暴露破坏甲状腺功能的生物标志物[19,20]。近年在关于女性甲状腺癌患病高易感性的研究中同样显示，雌激素及其受体与甲状腺癌的发展和发病机制有相关作用[21]。本研究显示，雌激素受体抑制剂(ICI182780)对各剂量砷暴露组E2、甲状腺功能指标(TT3、TT4、TSH)、ERα和TRα基因与蛋白表达水平的改变均有明显的反调节作用，说明砷可通过调节ERα受体影响甲状腺功能指标及受体表达情况，ERα可能是砷或E2作用于机体后导致甲状腺结构和功能损伤的中间途径之一。

本研究中雌激素效应或甲状腺功能影响，雌雄间指标改变不完全一致。低砷暴露导致的雌激素效应、甲状腺功能减退状况和高砷暴露导致的甲状腺功能损伤作用可能均为雌性强于雄性。Che等[22]表明，砷能提高ERα的表达水平，但这种改变存在性别上的差异。提示砷引发的雌激素效应可能通过除ERα以外的通路发挥作用，如MAPK/PI3K等通路；但也可能与雌雄体内雌激素水平及其对机体功能影响的差异性有关[10]。根据中砷组TRα基因与蛋白、ERα基因、TT3、TT4、TSH激素等指标的表达水平与低砷组、高砷组之间的比较发现，中砷组可能是雌激素效应转为甲状腺功能紊乱的中间剂量。中间剂量的作用途径可能结合了雌激素效应与砷毒性作用的两种机制。ERα与TRα的表达之间也可能存在关联。后续研究的优化可增设中间剂量组和抑制剂干预剂量组，并在0.8 mg/kg的剂量以下探究更低的砷暴露剂量是否对雄性大鼠有更显著的雌激素效应。

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文章来源：李宏昀,马晓薇,江志红,买哈巴·木合塔尔,吴军.大鼠砷暴露致雌激素效应及对甲状腺功能的影响[J].实用预防医学,2021,28(12):1415-1420.