牙本质是构成牙齿主体的硬组织部分,呈淡黄色,外侧有牙釉质与牙骨质包裹,约含有30%有机物和70%无机物。牙本质中存在牙本质小管,管中含有神经纤维及液体,能使外部刺激传入牙髓。牙齿受到磨损、龋病等刺激时,受刺激位置的近髓腔端可形成第三期牙本质以封闭牙本质小管,屏障外界刺激传入牙髓。但机体自身形成的修复性牙本质的量较少,不足以修复牙齿因龋病或磨损等造成的牙体缺损。骨形态发生蛋白是一种小的分泌性功能蛋白,作为形态发生因子参与了心脏、牙胚、神经和造血系统等多种组织和器官的发育过程。牙髓干细胞是从牙髓组织中分离出来的一种与骨髓间充质干细胞具有类似免疫表型的细胞[1],体外培养可形成矿化结节且具有自我更新和向多种细胞分化的潜能,在适当的微环境下可分化为成骨细胞、成牙本质细胞、神经细胞等[2,3]。本文就BMP调控DPSCs向成牙本质细胞分化的研究进展综述如下。

1、BMP生物学特性

BMP是一组高度保守且各亚型具有类似结构的分泌性功能蛋白,具有转化生长因子-β家族典型的胱氨酸结构域,调控多种细胞的分化和活性。已知的BMP有20多种亚型,除新发现的BMP-1属于金属肽链内切酶家族以外,余均属于转化生长因子-β家族[4]。BMP是低分子量(相对分子质量约30000)的糖蛋白,前体由信号肽、前功能区和1个成熟的羧基末端(C-末端)3部分组成,结构类似“一只手”的形状,包括1个长条状的α螺旋和2条平行的从α螺旋两端发出的β链,β链类似手指部分,α螺旋类似手掌部分。大部分BMP的C-末端含有7个半胱氨酸残基,其中6个半胱氨酸残基在多肽链内部形成二硫键,另1个参与肽键间二硫键的形成,使2个多肽键连接成二聚体。C-末端在蛋白水解酶作用下从前体上释放后,2个前体以二硫化物键相结合发生二聚作用,成熟有活性的二聚体BMP即被分泌出来。成熟的BMP蛋白是由二硫键连接的同型或异型二聚体,通过与受体相互作用及细胞内信号转导来触发细胞发育[5]。BMP根据氨基酸序列及结构等分为以下亚类[6]:(1)BMP-2和BMP-4氨基酸序列的同源性达86%,在胚胎发育的所有组织中有低水平BMP-2和BMP-4表达,其在骨骼发育及骨损伤修复中发挥作用;(2)BMP-3和BMP-3b为一类,对脑和肺组织的发育有一定作用;(3)BMP-9(GDF-2)和BMP-10为一类,在成骨细胞分化的早期及骨折愈合中发挥促进作用;(4)BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-8b(OP-2)为一类,BMP-5、BMP-6主要在肺组织表达,BMP-7主要在肾脏、膀胱和肾上腺组织表达,在这些组织的生长发育中起一定促进作用;(5)BMP-12、BMP-13和BMP-14为一类,BMP-12对较成熟或终末分化的成骨细胞具有较强的诱导作用。BMP作为多功能生长因子参与多种生物学过程,诱导软骨和骨骼的形成,在许多非成骨发育过程中也起一定的促进作用。在脊椎动物中BMP是表皮诱导的信号,能促进神经细胞向神经元表型发展,抑制成肌相关调节因子的活化,可通过诱导特异性转录因子将生肌细胞分化途径转化为造骨细胞分化途径,在早期胚胎发育时,对机体基本形态的形成有一定的控制作用。有研究结果[7]表明,BMP信号传导在牙齿发育、牙本质形成中起关键作用。Han等[8]制备小鼠前交叉韧带损伤模型,应用BMP联合富血小板纤维蛋白进行治疗,结果显示大鼠肌腱-骨愈合效果更好,认为联合治疗可有效提高利于血管生成的生长因子水平,减轻损伤部位的炎性反应,促进骨形成和肌腱再生。

2、BMP信号通路

BMP信号通路是由不同的BMP细胞外配体与跨膜受体结合后进入细胞,并与细胞内调节因子相互作用形成的一个连续路径。BMP受体有2种类型,分别是BMPⅠ型和Ⅱ型受体。细胞外BMP配体与Ⅱ型受体结合形成配体-受体复合物,再与Ⅰ型受体结合形成复合物,在复合物中,具有活性的Ⅱ型受体磷酸化并激活Ⅰ型受体,Ⅰ型受体磷酸化受体调节型SMAD(receptor-regulatedSMAD,R-SMAD)。R-SMAD为SMAD蛋白的一个亚组,包含用于转化生长因子-β和激活素信号传导的SMAD-2和SMAD-3,以及BMP信号传导的SMAD-1、SMAD-5、SMAD-8。磷酸化的R-SMAD与1个共同通路型SMAD(common-partnerSMAD,Co-SMAD)即SMAD-4结合形成1个异三聚体复合物,复合物易位至细胞核,与其他转录因子和转录辅激活因子或辅抑制因子一起激活或抑制基因表达,即所谓的SMAD依赖性或经典信号传导途径[9,10]。BMP也可通过SMAD非依赖性或非经典信号传导途径进行信号传导。BMP可激活不同的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK),如Erk、JNK和p38。BMP能激活转化生长因子激活激酶1,其是MAPK激酶(MAPKkinase,MAPKK)家族成员,位于JNK和p38的上游。BMP激活MAPK是否完全独立于经典的SMAD信号传导途径尚有争议,因已观察到SMAD和MAPK信号之间存在串扰。经典信号传导的主要机制是配体与Ⅰ、Ⅱ型受体结合,导致受体复合物的转磷酸化,进而通过磷酸化激活R-SMAD,随后形成R-SMAD/Co-SMAD复合物转移到细胞核中;对于非经典信号传导的分子事件顺序尚不明确。BMP可通过经典和非经典信号传导途径分别或共同对细胞生物学作出调节[11]。

3、BMP对DPSCs的作用

牙髓是位于牙髓腔中的疏松结缔组织,包含间充质细胞、神经、血管和淋巴等多种成分。间充质细胞分布在牙髓外周,在正常情况下保持静息状态,在受到刺激时能向成牙本质细胞等细胞转化,形成修复性牙本质,抵御外界刺激起到保护牙髓的作用。2000年Gronthos等[1]从牙髓中分离出一种具有较强分裂、克隆及多向分化潜能的细胞,称之为DPSCs。BMP在调控干细胞的分化与凋亡中发挥一定作用,其中BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9调控DPSCs的研究相对较多。有研究[12]表明,将BMP-7蛋白植入DPSCs可诱导其向牙源性转化,在诱导7d和14d时与对照组比较,BMP-7蛋白组牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、骨钙素、牙本质基质蛋白-1(dentinmatrixprotein-1,DMP-1)和转录因子2基因表达上调;进一步对DSPP、DMP-1和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)等牙源性分化所涉及的蛋白质进行免疫细胞化学染色,发现BMP-7处理的DPSCs中DSPP、DMP-1和ALP染色呈阳性或强阳性,表明相关成牙本质分化蛋白增加;采用实时荧光定量PCR法测定骨形态发生蛋白受体-1A(bonemorphogeneticproteinreceptors-1A,BMPR-1A)mRNA表达,发现BMP-7处理的细胞BMPR-1AmRNA相对表达量明显高于未处理的细胞,表明BMP-7诱导了成牙源性分化相关基因的上调;Westernblot结果显示BMP-7诱导增加了Smad5和p-Smad5蛋白的表达,认为BMP-7诱导DPSCs分化可能依赖经典途径完成。Hrubi等[13]研究发现,BMP-2蛋白在体外对DPSCs的增殖和分化表现出相反的作用,在1mg/mL浓度的BMP-2蛋白培养基中培养的DPSCs较对照培养基培养的细胞增殖速度慢,且细胞生长速率以浓度依赖性方式呈现出降低趋势。Zhu等[14]在骨诱导培养基和常规培养基中分别培养DPSCs,6d后进行茜素红染色,发现骨诱导培养基中DPSCs细胞染色与常规培养基比较染色略增强,但ALP活性未见明显差异;当补充BMP-2后,骨诱导培养基中的矿化作用明显增强,在钙沉积的同时,ALP活性增加,表明BMP对细胞的调控作用受到相关分子环境的影响。

4、不同BMP蛋白调控DPSCs成牙本质分化

4.1BMP-2蛋白

BMP-2是由396个氨基酸组成的多肽生长因子,相对分子质量约为30000的不含胶原的糖蛋白。天然的BMP-2主要以二聚体形式存在,分布在成骨细胞、成牙本质细胞等具有成骨倾向的细胞质中。有研究[15]表明,BMP蛋白出现在牙早期发育的各个时期,在上皮细胞与间充质细胞中相互作用。BMP-2在牙本质、牙釉质及牙周组织的发育形成过程中发挥重要促进作用。Guo等[16]发现,Bmp2基因敲除的小鼠釉基质蛋白如釉原蛋白、釉蛋白、釉基质蛋白酶表达下降,小鼠牙骨质形成及成牙本质终末分化出现缺陷,出现锥形牙、畸形牙及釉质发育不全等牙齿方面的缺陷,而添加外源性的BMP-2可上调其表达,上述缺陷得到一定程度改善。Li等[17]用Ca2+处理DPSCs后发现内源性BMP-2表达增加,DSPPmRNADMP-1mRNA表达上调,增加了牙本质的分化和矿化。高表达的BMP-2触发控制基因转录的BMP/Smad通路,并上调相关Smad蛋白表达,引起Smad1、Runx2mRNA及蛋白表达增加,表明BMP/Smad途径参与了DPSCs向成牙本质细胞的分化;随BMP-2表达增加转录因子2和DSPPmRNA及蛋白表达以时间依赖性方式提高,认为内源性BMP-2表达提高促进DPSCs向成牙本质分化。转录因子2和Smad1/5/8染色共定位在细胞核内,转录因子2与BMP介导的Smad1/5/8蛋白间存在相互作用。有研究结果[17]表明,内源性BMP-2表达上调,激活Smad1/5/8途径并促进DPSCs中Smad1-转录因子2、转录因子2-DSPP的相互作用,诱导靶基因转录,促进DPSCs向成牙本质细胞的转化。BMP-2在牙本质、牙釉质的发生及矿化过程中发挥了复杂而重要的调控作用,并对DPSCs向牙本质分化起到了积极的促进作用。

4.2BMP-4蛋白

BMP-4与BMP-2具有相同的受体,可能与BMP-2具有相似的功能。成熟的BMP-4是由116个氨基酸组成的具有高度保守性的BMP-4分子。成熟有活性的BMP-4同样以二聚体的形式存在,在牙胚发育、心脏形成以及干细胞分化等方面发挥重要作用[18,19]。小鼠牙胚发育过程中,在牙上皮中最早可见BMP-4表达,随后在蕾状期向牙间充质转移,BMP-4表达的转化与成牙潜能从上皮转移至间充质的时间相同,表明BMP-4是牙齿发育过程中一个重要的信号分子[20]。黄义德等[21]通过BMP-4慢病毒转染DPSCs使其高表达BMP-4,发现与空载病毒载体组相比,BMP-4组ALPmRNA和DSPPmRNA转录水平有所提高,牙本质特异性蛋白DSPP、骨钙素、骨桥蛋白分泌表达增强,表明BMP-4对DPSCs成牙本质分化表现出较强的诱导作用。刘晓影等[22]将小鼠牙上皮覆盖在DPSCs团块上制备成人鼠嵌合体,将吸附牛血清白蛋白的琼脂糖微球与嵌合体结合作为对照组,将浸泡过生长因子BMP-4的琼脂糖微球与嵌合体结合作为实验组,然后将2组嵌合体植入裸鼠肾囊膜下8周后取出,HE染色显示对照组的嵌合体只能形成纤维囊组织而未形成牙齿结构,实验组见肾囊膜下形成乳白色组织块,质地坚硬,直径约3～4mm;实验组经石蜡切片及特异性基因探针原位杂交检测有牙本质或牙髓结构的形成,且成牙本质细胞呈高阳性信号表达,而对照组嵌合体形成厚约1～2mm扁平骨片,石蜡切片及原位杂交检测显示为松质骨组织及上皮组织,未见牙齿结构形成;表明BMP-4增强了DPSCs向牙本质分化,在促进DPSCs向牙本质分化过程中发挥积极作用。

4.3BMP-7蛋白

BMP-7前体由431个氨基酸组成,成熟有活性的BMP-7含有139个氨基酸,同样以二聚体的形式存在[23]。BMP-7及其下游信号通路(P-Smad1/5/8)在牙胚间充质中均有表达,并参与牙冠向牙根发育这一转化过程。BMP-7在上皮根鞘中也有表达,参与了上皮根鞘的形成与转归,对牙根的形成、大小、形状等可产生影响[10]。马娟等[24]将DPSCs分别接种于含100μg/LBMP-7的体积分数5%FBSα-MEM培养液中(实验组)和不含BMP-7的培养基(对照组),发现BMP-7诱导后细胞形态与诱导前未见明显差异;2组BMP-7诱导后第1、3、5天DPSCs增殖比较差异无统计学意义,诱导后第7天对照组细胞生长较实验组迅速,说明BMP-7对细胞的增殖有影响,蛋白处理时间的延长可减慢细胞的生长;细胞免疫化学染色发现,诱导第7天ALP、DMP-1、DSPP在对照组表达较低或仅有个别细胞表达,而实验组DSPP、DMP-1表达增强,ALP染色呈强阳性。有研究[25]发现,Dmp1缺陷小鼠出现了前牙牙本质矿化障碍,牙腔增大,牙本质层厚度变薄和矿化不足等重要特征;经BMP-7诱导后DSPP、DMP-1表达明显上调,说明BMP-7在DPSCs向成牙本质细胞分化中发挥正向调控作用。有学者[14]认为,细胞的增长和分化是相对立的发展趋势,在分化中增殖将会受到部分抑制,其发展过程受细胞增殖信号和分化信号的相对平衡调节。Zhu等[12]实时荧光定量PCR检测结果显示,BMP-7处理的DPSCs中ABMPR1A/ALK-3和Smad5mRNA相对表达量较对照组上调;Westernblot结果表明,BMP-7以剂量依赖性增加了Smad5和p-Smad5蛋白的表达,提示BMP-7可通过ABMPR1A/Smad5信号通路诱导DPSCs向牙本质分化。因此,BMP-7对DPSCs的成牙本质分化起积极的正向调控作用,并可能通过Smad经典途径中Smad5信号实现。

4.4BMP-9蛋白

BMP-9也称生长分化因子2,其前体蛋白由428个氨基酸组成,氨基酸序列与BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7有50%～55%的同源性[26]。BMP-9在骨形成、牙齿发育和干细胞分化中起重要作用,在成骨方面较BMP-2、BMP-7有更强的成骨诱导能力,是刺激间充质干细胞成骨分化的有效细胞因子之一。Huang等[7]制备Bmp9基因敲除小鼠模型,发现小鼠牙尖明显磨损、牙根较短;CT和三维重建分析发现敲除小鼠第一磨牙牙本质厚度减少、牙髓腔增大、牙根缩短,出现了类似于遗传性牙本质发生不全症的表现,表明BMP-9可能在调节牙本质生成和牙齿发育中起重要作用。Wang等[27]以腺病毒过表达BMP-9转染DPSCs为实验组,以空载病毒转染DPSCs为对照组,发现与对照组比较实验组DSPPmRNA、转录因子2mRNA、DMP-1mRNA及蛋白表达均上调,ALP染色呈阳性表达,茜素红染色钙盐沉积水平更高,表明BMP-9可促进DPSCs向成牙本质分化,但具体机制尚不清晰。

5、结语

DPSCs是用于牙齿再生的重要细胞来源,在外部刺激下被激活增殖和分化,从静止状态到活动状态的过程中可发生复杂的信号级联,但确切机制尚无定论。合适的活性因子能够在体外诱导DPSCs分化为预期的细胞类型,有利于牙体缺损的再生修复。BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9对DPSCs的形态及增殖的调控有一定作用,在促进DPSCs的多谱系分化方面作用明显,提高了DPSCs向成牙本质细胞、成骨细胞的分化能力。BMP调控了DPSCs向成牙本质细胞方向分化,与牙本质的再生密切相关,但不同的BMP调控DPSCs分化的机制尚不明确,是否有其他信号通路共同作用有待进一步研究。随着研究的深入,DPSCs定向分化及相关活性因子利用组织工程技术实现牙齿组织的再生及治疗其他疾病将成为可能。

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