心血管疾病死亡的主要原因是急性心肌梗死。经皮冠状动脉介入术、药物溶栓、冠状动脉旁路移植术等可缩小急性心肌梗死面积,是保护濒临死亡心肌的最有效方法。但血管再通与血流恢复引起血管内皮细胞功能异常及炎性因子激活,加剧了细胞死亡,可导致心肌缺血再灌注损伤[1]。远端缺血预适应可减轻心肌缺血再灌注损伤[2],多种治疗方法靶向心肌缺血再灌注损伤可能更有益。自噬广泛存在于真核细胞内,对维持细胞存活,物质再利用和内环境稳态有重要作用[3]。自噬参与心肌缺血再灌注损伤的病理过程,但其分子机制尚未完全明确。研究[4]证实,真核生物信使RNA(messengerRNA,mRNA)修饰是一种新的表观遗传调控方式,最常见的修饰包括N6腺苷碱基的甲基化即N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)、5-甲基胞嘧啶羟基化、N1-甲基腺苷等。m6A修饰的潜在调节作用可能影响多种心血管疾病的发生、发展[5]。本文就m6A修饰调控细胞自噬、参与心肌缺血再灌注损伤的潜在机制的研究进展综述如下。

1、心肌缺血再灌注损伤的可能机制

心肌缺血再灌注损伤是指心肌恢复血流灌注后,结构和功能未能恢复,并产生更严重的损伤,其发生与氧化应激、炎性反应、细胞内钙超载和线粒体功能障碍以及细胞自噬有关。

1.1氧化应激

在缺血缺氧的氧化应激状态下,细胞内代谢紊乱,氧自由基清除能力不足,而再灌注时,可经线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等途径产生大量活性氧。自由基产生后可损伤细胞膜结构,使细胞膜失去正常屏障功能,通透性增加,细胞内外的物质顺浓度流动,细胞失去正常功能;自由基还可通过氧化破坏机体蛋白,改变蛋白酶表面结构使其失去功能;自由基可致遗传物质DNA、RNA断裂,核酸失去正常功能,最后导致细胞凋亡,从而引起心肌损伤。

1.2细胞内和线粒体钙超载

正常情况下,细胞外Ca2+浓度高于细胞内,钙泵将细胞内多余的Ca2+转运至细胞外,保持细胞内合理的钙浓度。心肌发生缺血和再灌注损伤时,心肌细胞膜结构损伤,细胞膜通透性增加,细胞外Ca2+顺浓度梯度进入细胞内;同时,三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)生成减少或缺乏,使钙泵失活,不能及时泵出Ca2+;组织缺血缺氧导致细胞内pH值下降,细胞膜Na+/H+交换泵、Na+/Ca2+离子泵作用增强,使细胞内H+浓度降低、Ca2+浓度升高。钙超载可引起线粒体膜通透性转换孔开放,线粒体膜电位异常,促进凋亡因子释放,激活钙蛋白酶,促进炎性反应发生。

1.3线粒体功能障碍

线粒体是细胞内产生能量的主要场所。在心肌缺血再灌注过程中,线粒体钙超载和大量活性氧产生均可导致线粒体损伤。线粒体通透性转换孔是位于线粒体内外膜上的一种非特异性通道,缺血期间保持关闭状态,再灌注时保持开放状态。钙超载可引起线粒体膜通透性转换孔开放,线粒体膜电位异常,进一步导致ATP合成受损,活性氧产生,线粒体水肿,外膜破裂,促进细胞色素C和凋亡因子释放,最终导致细胞死亡。

1.4炎性反应

炎性反应是心肌缺血再灌注损伤的另一个重要因素,涉及先天性和适应性免疫反应的募集和激活,并导致心肌损伤。

1.5细胞自噬

细胞自噬指囊泡包被细胞质中线粒体等细胞器,形成双层膜结构自噬体,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物进行细胞代谢和更新。一般哺乳动物细胞自噬分为3类[3]:(1)大自噬/宏自噬:细胞质中可溶性大分子物质、变形细胞器可被内质网、线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体,随后与溶酶体融合为自噬溶酶体,以内含的水解酶降解相应底物来完成自噬。此过程是自噬的典型过程。(2)小自噬/微自噬:该过程并不会形成自噬体,而是溶酶体膜自身发生内陷,直接包裹和吞噬细胞内待降解的底物,并在溶酶体内发生降解。(3)分子伴侣介导的自噬:分子伴侣蛋白识别并结合带有特定氨基酸序列的可溶性蛋白质,再经溶酶体膜上的受体Lamp2a转运至溶酶体内被水解酶降解,但在降解蛋白时具有选择性。自噬的形成过程包括自噬诱导、囊泡形成、囊泡延伸、成熟等阶段。自噬机制的受损与心血管疾病、神经退行性疾病以及肿瘤等密切相关。自噬对心肌缺血和再灌注两个阶段具有双向调节作用。心肌缺血时,ATP浓度降低,一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate,AMP)/ATP比例增高,可激活AMP依赖的蛋白激酶(adenosine5'-monophosphate-activatedproteinkinase,AMPK),对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)复合物mTORC1产生抑制作用,导致与其结合的自噬蛋白unc-51样激酶(unc-51likeautophagyactivatingkinase,ULK)1复合物释放,即经AMPK-mTORC1-ULK1途径激活自噬,产生ATP应对能量危机,对心肌细胞发挥保护作用;在再灌注阶段,活性氧爆发导致自噬相关蛋白Beclin-1上调,刺激自噬从而加重心肌细胞的损伤[6]。

2、m6A修饰

哺乳动物中可检测到7000个左右基因发生m6A,m6A修饰包含在共有序列5'-RRACH-3'(R=A或G;H=A,C,orU)中,且这些位点主要分布在终止密码子附近以及3'UTR。m6A可调节多种类型细胞的生长,与人类肿瘤及心血管疾病等有关[7]。

m6A修饰过程主要涉及3类催化酶:(1)甲基化转移酶:包括甲基转移酶样(methyltransferase-like,METTL)3、METTL14、Wilms肿瘤蛋白-1相关蛋白(Wilmstumor1-associatedprotein,WTAP)、KIAA1429(VIRMA/VIRILIZER)和NA结合基序蛋白15。METTL3、METTL14、WTAP构成催化m6A甲基化的甲基转移酶复合物核心成分,其中METTL3具有催化亚基活性,METTL14充当METTL3的结构支持,WTAP稳定核心复合物。NA结合基序蛋白15有助于将复合物募集到其靶位[8]。目前KIAA1429的分子功能尚不明确。(2)去甲基化酶:包括α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同系物5(α-ketoglutarate-dependentdioxygenasealkBhomolog5,ALKBH5)、脂肪量和肥胖相关蛋白(fatmassandobesityassociatedprotein,FTO)。FTO是哺乳动物中发现的第1个去甲基化酶,ALKBH5影响mRNA的输出和RNA代谢及加工[7]。(3)甲基化识别酶:包括核不均一YTH结构域蛋白,核糖核蛋白以及胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白等。其中YTH结构域蛋白包括YTHDC1/2和YTHDF1/2/3。甲基化识别酶可识别发生m6A修饰的碱基,参与下游mRNA翻译、降解及微小RNA的加工[9]。

3、m6A修饰与心脏功能调控

心肌缺血再灌注损伤导致心肌细胞水肿、出血、坏死,发生心肌肥大重塑,影响心脏舒缩功能,最终导致心力衰竭和心律失常。m6A修饰为基因转录后调控的发展提供了新的视野。Preissl等[10]通过分析心脏不同类型细胞特异性核mRNA和表观遗传修饰,揭示了心肌细胞中基因表达调控的表观遗传机制。

3.1m6A与心肌缺血

Saxena等[11]提出,m6A可影响mRNA的半衰期,导致心脏保护性蛋白表达,从而缩小缺血心肌梗死面积,将m6A引入心脏保护领域。有研究[12]检测心肌梗死患者和正常对照者心肌组织METTL3基因的表达,发现与正常对照者心肌组织相比,心肌梗死患者心肌组织METTL3表达上调。研究[13]表明,ALKBH5过表达可逆转心肌缺血再灌注损伤,提示m6A在缺血性心脏病中的重要性。此外,Fto过表达心肌梗死小鼠心肌纤维化减轻,新生血管生成增多,说明Fto过表达可调节m6A水平并改善心肌梗死后的心功能[13]。

3.2m6A与心肌肥大

增强m6A水平导致代偿性心肌肥大,减少m6A导致离心性心肌细胞重构和功能障碍[14],表明METTL3控制心肌细胞中的基因表达,调节心脏重塑和功能。

3.3m6A与心力衰竭

Mathiyalagan等[13]研究发现,在心力衰竭哺乳动物的心脏中FTO表达降低,增加收缩转录本SERCA2a和RYR2中m6A水平,引起异常钙稳态并降低心脏收缩功能,表明FTO在心力衰竭期间心脏收缩功能维持中发挥了重要作用。Berulava等[15]报道,m6A可影响RNA翻译和蛋白质产生,并参与心力衰竭的进展。

3.4m6A与心律失常

FTO与多种心脏缺陷有关,包括肥厚性心肌病,室间隔缺损、心律失常等。Carnevali等[16]研究发现,小鼠FTO缺乏可导致心脏的交感神经调节失衡,电生理性和结构特性紊乱,发生心律失常。

3.5m6A与高血压

m6A在血压调节中起重要作用。Su等[17]研究了缺氧性肺动脉高压中m6AcircRNA的转录组全图,确定了影响缺氧性肺动脉高压circRNA-miRNA-mRNA共表达网络的m6A水平。通过METTL3和FTO靶向调节m6A可能作为高血压和心血管疾病的潜在诊断方法和治疗方法[18]。心脏修复与再生治疗是临床研究的重点[19],m6AmRNA甲基化调控心脏基因表达和细胞生长[20],为心肌缺血再灌注损伤后改善心脏功能和心肌修复再生提供新概念。

4、m6A调控自噬

m6A通过调节细胞自噬,在癌症、生殖及心血管系统等方面发挥重要作用。

4.1自噬诱导阶段

mTOR是自噬诱导过程中的关键分子,激活mTOR的通路如磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)-1/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)/Erk信号通路可抑制自噬,负调控mTOR的通路如AMPK和p53信号通路可促进自噬。哺乳动物自噬发生主要受ULK复合物调控,该复合物包括ULK1/2、ATG13、ATG101、FIP200[21]。正常情况下,AMPK失活,mTORC1与ULK1/2相互作用并使其失活;当缺血缺氧或其他刺激时,AMPK活化,mTOR失活,激活ULK1/2使ATG13、ATG101和TIP200磷酸化,从而启动自噬。FTO与mTORC1的活性相关,FTO缺乏可减少mTORC1通路的激活,降低mRNA的翻译率,增加自噬[22]。研究[23]发现,FTO靶向ULK1转录物上的m6A位点催化脱甲基化并调控ULK1蛋白丰度,且FTO不影响ULK1mRNA自细胞核至细胞质的转运。mTOR是心肌缺血阶段调控自噬的核心蛋白,通过抑制mTOR激活自噬缓解心肌缺血再灌注损伤。因此,FTO-mTORC1轴的激活是否通过抑制自噬参与心肌缺血再灌注损伤尚待阐明。低氧诱导因子1是一种核转录因子,在缺氧/复氧条件下其转录水平和蛋白表达明显提高,并促进缺氧引起的自噬诱导,减轻缺氧诱导心肌损伤[24]。FTO表达在低氧胁迫下受到调节,了解FTO是否影响低氧诱导因子1及其下游靶基因有重要意义[25]。在缺氧条件下,低氧诱导因子1α通过与启动子相互作用而提高了ALKBH5的表达[26]。在心肌缺血再灌注损伤中,低氧诱导因子1是否通过调节ALKBH5影响m6A从而调控心脏功能有待进一步研究。

4.2囊泡成核阶段

由hVps34、Beclin-1、p150和ATG14或抗紫外线照射相关基因组成的Ⅲ型PI3K复合物的激活触发初始自噬膜形成,形成具有双层膜杯状分隔膜的自噬前体[21]。哺乳动物中,自噬相关蛋白Beclin-1与B淋巴细胞瘤-2(B-celllumphoma-2,Bcl-2)相互作用并抑制自噬,而自噬作用的触发则需Beclin-1从Bcl-2上解离下来。上皮性卵巢癌组织中m6A去甲基化酶ALKBH5表达增加,促进Bcl-2和Beclin-1之间的相互作用并抑制自噬;泛素样ATG5、ATG7、Ⅲ型PI3K、Beclin-1和ULK1的敲低逆转了siALKBH5诱导的微管相关蛋白轻链3(lightchain3,LC3)的积累;ALKBH5还可通过MAPK/Erk和PI3K/Akt/mTOR途径调控自噬[26]。

4.3自噬体延伸阶段

自噬体形成是一个复杂过程,自噬体膜延伸通过募集两个泛素样蛋白偶联途径,包括ATG12系统和LC3系统[6]。在泛素样ATG12途径中,ATG12依次结合ATG7和ATG10与ATG5相互作用形成ATG12-ATG5复合物,随后与ATG16L1结合形成一个大型的多聚体复合物,从而募集LC3-PE促进膜的形成。LC3途径中,ATG4将pro-LC3裂解为LC3-Ⅰ,随后在ATG7和ATG3的催化下,LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺共价结合,加工成与荧光团结合的LC3-PE(LC3-Ⅱ),参与膜的延伸。LC-3Ⅱ定位于自噬体膜,为自噬体的标志性分子,反映自噬水平。研究[27]发现,FTO以m6A依赖性方式直接靶向ATG5和ATG7转录本,在敲低FTO后,YTHDF2识别m6A水平较高的ATG5和ATG7转录本,导致mRNA降解、蛋白表达降低,从而抑制自噬和脂肪形成。有研究[28]报道,睾丸激素合成过程中Leydig细胞中m6A修饰与自噬之间存在负相关,METTL14表达下降导致m6A水平降低,通过调节AMPK活性,导致LC3自噬水平增强。此外,FTO通过增强LC3β的积累和p62的消耗调节自噬[22]。

4.4自噬溶酶体成熟与裂解阶段

自噬体成熟后,其外膜与溶酶体膜融合,形成自噬溶酶体,溶酶体将自噬体内膜和内容物降解,实现细胞的物质代谢和细胞器更新。这种融合依赖于细胞内微管,由Rab7-SNARE、SKD1等蛋白及溶酶体膜蛋白LAMP1/2参与[21]。在哺乳动物细胞中,一系列溶酶体蛋白酶是自噬小体内含物降解所必需的。梗死心肌组织中METTL3表达明显上调,损害自噬通量并促进缺氧-复氧心肌细胞凋亡。从机制上讲,溶酶体生物发生和自噬基因的主要调控者转录因子EB(transcriptionfactorEB,TFEB)在3'-UTR中有2个m6A残基,在缺氧-复氧心肌细胞中,METTL3依赖的m6A甲基化TFEB,从而促进RNA结合蛋白异构核糖核蛋白D与TFEBpre-mRNA结合,降低TFEB表达。去甲基化酶ALKBH5过表达可逆转METTL3对缺氧-复氧心肌细胞的损伤。因此,METTL3-ALKBH5与自噬之间有紧密联系,研究可逆性m6AmRNA甲基化在缺血性心脏病中的作用有重要意义[12]。

5、结语

近年,表观遗传修饰在心血管疾病发病中作用的研究较多[29],但人类心脏病中m6A修饰的潜在调节机制仍未完全明确。作为新兴领域,RNA甲基化谱图可能为心肌缺血再灌注损伤的预防、诊断及治疗提供新思路。作为最丰富的mRNA转录后修饰,m6A甲基化参与从DNA损伤和免疫反应到细胞凋亡,自噬和衰老的不同生物学过程[5]。自噬与心脏稳态过程密切相关,可能受m6A动态可逆调节。除自噬外,心脏病理还涉及其他类型的细胞死亡,如细胞凋亡。因此,研究侧重于不同类型的心脏细胞死亡是必要的。

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