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吸烟状态和TGM-3表达对口腔白斑微环境和恶性转化的影响

2024-11-20 74 上传者：管理员

摘要：目的探究吸烟状态和转谷氨酰胺酶-3（TGM-3）mRNA表达对口腔白斑（OL）微环境和恶性转化的影响。方法回顾性纳入东营市人民医院2017年5月至2019年6月所有OL活检组织样本的病理报告和临床资料进行分析。收集OL患者的吸烟状态、5年口腔无恶性转化生存期（MTFS）等信息。分别采用逆转录聚合酶链式扩增技术及免疫组织化学法检测组织TGM-3 mRNA表达及上皮下组织域CD163+、CD8+细胞计数。结果本研究最终纳入了88例患者，共63例非吸烟者，25例吸烟者。吸烟者年龄<60岁的概率更高（P<0.05）。此外，吸烟者拥有更高的5年恶性转化率（P<0.05）。相较于非吸烟者，组织TGM-3 mRNA表达在吸烟者中下调，CD163+细胞计数增加。经COX回归分析，组织TGM-3 mRNA表达<1.70为非吸烟者恶性转化的危险因素，CD163+细胞计数≥1 043.33 mm2、组织TGM-3 mRNA表达<1.00仍为吸烟者恶性转化独立危险因素。使用Kaplan-Meier生存曲线分析，非吸烟者组织TGM-3 mRNA表达<1.70的中位5年MTFS（中位数为4.7个月，范围为0.2～55.3个月）短于组织TGM-3 mRNA表达≥1.70的患者（中位数为7.7个月，范围为0.1～52.5个月），差异有统计学意义（χ2=8.134,P=0.004）。吸烟者组织TGM-3 mRNA表达<1.00的中位5年MTFS（中位数为2.5个月，范围为0.5～37.6个月）显著短于组织TGM-3 mRNA表达≥1.00的患者（中位数为19.1个月，范围为2.2～39.0个月），差异有统计学意义（χ2=12.259,P<0.001）。结论联合吸烟状态和组织TGM-3 mRNA表达可预测OL恶性转化。

关键词：
OL
口腔白斑
吸烟状态
微环境
转谷氨酰胺酶-3
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口腔白斑（OL）是常见的口腔癌前病变，其自然史的特征仍然不明确[1-2]。对OL观察性研究的系统综述报告了其恶性转化率为1.1%～40.8%[3-4]。已有研究表明，吸烟和免疫微环境与OL和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的发病风险增加有关[5-6]；但两者的关系尚未阐述清楚，例如，OL的微环境是否因吸烟状态而异。转谷氨酰胺酶-3(TGM-3）是一种负责表皮形成过程的交联酶家族蛋白，在多种上皮癌变中发挥关键作用，包括口腔癌、喉癌、食管癌、结直肠癌和肝细胞癌[7-8]。目前，临床对TGM-3与口腔恶性疾病关系的研究较为少见。为探究吸烟状态和转谷氨酰胺酶-3(TGM-3)mRNA表达对口腔白斑（OL）微环境和恶性转化的影响，本研究检测了吸烟和非吸烟患者OL微环境中TGM-3mRNA表达、上皮CD163+肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和CD8+细胞（淋巴细胞）计数的差异，并研究吸烟状态和这些免疫标志物的表达是否预示着恶性转化。

1、材料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析东营市人民医院口腔科2017年5月至2019年6月采集的所有OL活检组织样本的病理报告和临床资料。本研究获得了医院伦理委员会的批准（20190027）并按照《赫尔辛基宣言》执行。纳入临床表现为口腔黏膜白色斑块（病变），病理诊断为OL伴上皮异常增生（OED）的病变。排除标准包括既往或首次诊断为OED合并OSCC、样本分析不足以及临床信息不足的病例。

1.2 资料收集

从患者病历中检索患者的年龄、性别、吸烟和饮酒习惯、病变部位、组织病理学特征和治疗方法类型等临床信息，并收集患者的随访资料。评估所有OED患者的5年口腔无恶性转化生存期（MTFS），并将其定义为诊断至首次组织学证实的口腔癌之间的时间间隔（月）。对所有组织样本进行3μm厚切片，常规HE染色，在光镜下进行组织病理学观察。

由两名经验丰富的观察员使用2017年世界卫生组织（WHO）的异常增生分级[9]将OED分为轻度、中度和重度。为了进一步的统计分析，OED被分为低级别（轻度OED）或高级别（中度OED和重度OED）。

香烟当量的计算方法如下：一烟斗等于三支香烟，一根雪茄等于两支香烟。吸烟者被定义为一生中吸烟量≥100支香烟的人。当前饮酒者被定义为在诊断日期前一年内饮用任何类型酒精饮料的人，既往饮酒者被定义为从未饮酒或在诊断日期前停止饮酒>1年的人[10]。复发定义为全切除（包括切除性活检）后同一活检部位出现OED。

1.3 逆转录聚合酶链式扩增（qtRT-PCR）技术

使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）从冷冻组织样本中提取RNA。用PrimerScript RT试剂盒（宝日医生物技术（北京）有限公司）逆转录1μg总RNA。采用ABI7300实时定量PCR系统（美国Applied Biosystems公司）和SYBR Premix Ex Taq试剂盒（宝日医生物技术（北京）有限公司）对逆转录得到的互补DNA和特异性引物进行实时PCR。

引物的具体情况如下：

TGM-3引物（21 bp）序列：

上游：5’-GTCCGTGCCATTCCCAGAG-3’

下游：5’-AGATGCCATGCACTCACCAG-3’

β-actin（内参）引物（21 bp）序列：

上游：5’-CCCAGATTGGGGACAAAGGAA-3’

下游：5’-CGCCTCCGACCAGTGTTTG-3’。

PCR体系总体积为20μl，含浓度为20 ng/μl的模板cDNA1μl，含10μl的SYBR Premix Ex Taq,0.4μl的ROX Reference Dye，上、下游引物（浓度：0.2μmol/L）各0.2μmol。

反应程序：95℃、30 s;95℃、5 s,60℃、31 s,40个循环。

实时荧光PCR的结果定义为Ct值，Ct值代表样本荧光信号超过基线值时通过给定阈值的循环数。ΔCt为特定基因与同一样本β-actin的Ct值差异。相对表达水平确定为2-ΔΔCt，其中，ΔΔCt=OED组织样本的ΔCt值-病变旁正常组织样本的ΔCt值，从而表明OED组织样本相对于病变旁正常组织样本的倍数变化。

1.4 CD163+和CD8+检测

在距基底膜≤60μm的上皮下组织区域采用免疫组化法计数CD163+和CD8+细胞数量。将3μm厚度的石蜡OED组织样本切片进行脱蜡和水化处理。用枸橼酸缓冲液（pH 6.0）微波载玻片处理30 min。用甲醇制备的0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。用抗CD163(1∶50稀释，美国Thermo Fisher Scientific公司）或抗CD8抗体（1∶100稀释，丹麦Dako公司）在室温下染色至少2 h。随后用EnVision FLEX二抗孵育1 h。用3,3-二氨基联苯胺显色后，用Mayer苏木精复染。随机选取5个高倍视野（40×物镜，10×目镜），计算平均每mm2计数。

1.5 统计学方法

采用软件名称、版本号进行t检验、χ2检验和Mann-Whitney U检验以分析吸烟状态与提取的临床病理参数之间的关系。采用单因素及多因素COX回归模型分析与患者相关的恶性转化危险因素。生存率采用Kaplan-Meier分析，生存率曲线的比较采用log-rank检验。以P<0.05差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 不同吸烟状态的临床病理特征

本研究最终纳入了88例患者，其中，有63例非吸烟者，25例吸烟者。吸烟组和非吸烟组只有年龄（P<0.05）和恶性转化率（P=0.001）存在显著差异。见表1。

表1 临床病理特征在不同吸烟状态患者中的分布

2.2 吸烟状态与TGM-3、CD163+、CD8+的表达

与吸烟组比较，非吸烟组患者组织中TGM-3 mRNA的表达和CD163+细胞计数均较高，差异有统计学意义（P<0.05）；而CD8+细胞计数无明显改变。见表2。

表2 吸烟状态与TGM-3 mRNA表达水平和CD163+、CD8+细胞计数的关系[M(P1,P100)]

2.3 与吸烟状态相关的恶性转化危险因素

组织TGM-3 mRNA表达、CD163+细胞计数、CD8+细胞计数根据非吸烟者及吸烟者各组的中位值进行分组。经单因素COX回归分析，组织TGM-3mRNA表达<1.70为非吸烟者恶性转化的危险因素，而在吸烟者中CD163+细胞计数≥666.67 mm2、组织TGM-3 mRNA表达<1.00均为恶性转化危险因素，见表3。

经多因素COX回归分析，CD163+细胞计数≥1 043.33 mm2、组织TGM-3 mRNA表达<1.00仍为吸烟者恶性转化独立危险因素。见表4。

表3 单因素COX回归分析与非吸烟者相关的恶性转化危险因素

表4 单因素及多因素COX回归分析与吸烟者恶性转化相关的独立危险因素

2.4 吸烟状态和组织TGM-3 mRNA表达对恶性转化的联合作用

使用Kaplan-Meier生存曲线分析，非吸烟者组织TGM-3 mRNA表达<1.70的中位5年MTFS（中位数为4.7个月，范围为0.2～55.3个月）短于组织TGM-3 mRNA表达≥1.70的患者（中位数为7.7个月，范围为0.1～52.5个月），差异有统计学意义（χ2=8.134,P=0.004）。见图1。

吸烟者组织TGM-3 mRNA表达<1.00的中位5年MTFS（中位数为2.5个月，范围为0.5～37.6个月）显著短于组织TGM-3 mRNA表达≥1.00的患者（中位数为19.1个月，范围为2.2～39.0个月），差异有统计学意义（χ2=12.259,P<0.001）。见图2。

图1 非吸烟患者不同组织TGM-3 mRNA表达的Kaplan-Meier生存曲线

图2 吸烟患者不同组织TGM-3 mRNA表达的Kaplan-Meier生存曲线

3、讨论

本研究分析了不同吸烟状态OL患者的临床病理特征、组织TGM-3 mRNA表达以及OL微环境中上皮下CD163+和CD8+细胞计数，结果显示，吸烟者年龄<60岁患OL的概率更高，此外，吸烟者拥有更高的5年恶性转化率。而吸烟者与非吸烟者的性别、OED分级、饮酒史、病变位置、手术切除、切除后复发等均无统计学差异。既往研究发现，OL的恶性转化与香烟烟雾暴露密切相关[11]，与本研究结论较为一致。

口腔组织为香烟烟雾刺激的第一个部位，而吸烟是许多口腔疾病最确定的主要危险因素之一，包括牙周病、龋齿、牙周炎等。吸烟也是促进口腔潜在恶性疾病和口腔鳞状细胞癌最重要的病因因素。OL的发生与烟草成瘾密切相关；此外，吸烟和OL之间的相关性通过剂量依赖性方式得到强调，吸烟复杂的致病作用被认为是导致OL甚至其恶性转化的原因[11-12]。烟雾刺激通过影响巨噬细胞的极化和吞噬作用来影响免疫环境。巨噬细胞的两种主要激活程序被称为M1和M2极化。M1型巨噬细胞促进炎症反应，与组织破坏相关，但也与肿瘤防御相关。M2型巨噬细胞具有免疫调节特性，不仅与伤口愈合、组织修复、新生血管生成相关，还与免疫抑制和肿瘤进展相关[13]。Zhu等[14]研究的结果表明，M2极化随着烟雾暴露而增加，随着M1型巨噬细胞向M2型极化，M1型巨噬细胞数量减少。在吸烟促进OL的过程中，谷氨酰胺代谢和巨噬细胞的M2极化在调节口腔黏膜免疫微环境和上皮异常增生和角化中发挥重要作用。CD163是目前公认的M2型巨噬细胞标志物[13]。CD163是免疫抑制性TAM的特征性标志物，而CD8表达于细胞毒性T淋巴细胞表面。本研究结果显示，与吸烟组比较，非吸烟组患者CD163+细胞计数较高而CD8+细胞计数无明显改变；且CD163+细胞计数≥1 043.33 mm2为吸烟者恶性转化独立危险因素。这提示了吸烟者与非吸烟者的OL微环境存在差异，吸烟者拥有更高的5年恶性转化率可能与此相关。

此外，本研究还分析了吸烟状态与组织TGM-3mRNA表达的关系，并探讨了其是否可以预测OL恶性转化。TGM-3基因编码的TGM-3广泛表达于小肠、脑、皮肤和黏膜。在皮肤和黏膜中，TGM-3主要表达于复层鳞状上皮的基底层上。近年来的研究表明，TGM3基因的下调与多种人类肿瘤类型密切相关，包括喉癌、食管癌和口腔鳞状细胞癌[15]。Feng等[15]研究发现，TGM-3在结直肠癌组织中表达水平显著下调，并与肿瘤侵袭转移和患者预后相关；通过在结直肠癌细胞中抑制和过表达TGM-3，该研究发现TGM-3可能通过促进肿瘤细胞凋亡和细胞周期调节来抑制细胞增殖。此外，TGM-3还能抑制肿瘤的侵袭和转移，且既往已有研究在头颈部鳞状细胞癌、食管癌和结直肠癌中发现TMG-3表达下调[8]。据报道，TGM-3的mRNA和蛋白表达在OL细胞和样本中经常下调[16]。DNA高甲基化是TGM-3表达下调的机制之一。TGM-3过表达和沉默通过凋亡相关蛋白的失调影响OL细胞的增殖、克隆形成和凋亡。较低的TGM-3水平与上皮异常增生分级和食管鳞状细胞癌发展密切相关[16]。在本研究中，也得出相似结论，在吸烟者及非吸烟者中组织TGM-3mRNA表达低表达均为恶性转化危险因素。非吸烟者组织TGM-3 mRNA表达<1.70的中位5年MTFS（中位数为4.7个月，范围为0.2～55.3个月）短于组织TGM-3mRNA表达≥1.70的患者（中位数为7.7个月，范围为0.1～52.5个月）；吸烟者组织TGM-3 mRNA表达<1.00的中位5年MTFS（中位数为2.5个月，范围为0.5～37.6个月）显著短于组织TGM-3 mRNA表达≥1.00的患者（中位数为19.1个月，范围为2.2～39.0个月）。这提示组织TGM-3 mRNA低表达吸烟者OL恶性转变的风险更大。

综上所述，在非吸烟患者中，OL与上皮下区域CD163+细胞数量相关，提示OL微环境受吸烟状态影响。此外，相较于非吸烟者，组织TGM-3 mRNA低表达吸烟者OL恶性转变的风险更大。联合吸烟状态和组织TGM-3 mRNA表达可预测OL恶性转化。然而，本研究也存在局限性。首先，本研究仅纳入了伴OED的OL患者；其次，本研究纳入病例较少，且为回顾性研究，可能会导致结果的偏差。未来应扩大样本量，开展前瞻性研究验证本研究结果。

参考文献:

[3]周珊珊,孔宇航,张劲松.光动力疗法对口腔白斑的疗效及影响因素的meta分析[J].重庆医学,2023,52(6):906-912.

基金资助:山东省医药卫生科技发展计划项目(202103010741);

文章来源:李磊磊,赵华江,王玉美.吸烟状态和TGM-3表达对口腔白斑微环境和恶性转化的影响[J].环境与健康杂志,2024,41(11):967-971.