口腔是头颈部肿瘤的好发部位之一。在口腔肿瘤中，90%以上的病理类型为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)[1]。OSCC作为一种生存率低且易早期转移和复发的恶性肿瘤，治疗上仍以外科手术为主[2]。尽管近年来各种手术、放化疗以及免疫治疗技术不断改进，但患者的远期生存率仍不理想[3]。此外，OSCC的传统治疗方法存在一些局限性，例如治疗效果有限、放化疗毒性和药物耐药性等。针对这些局限性，研究人员和临床医生正在努力寻找新的治疗策略和技术，以改善OSCC的治疗效果。目前靶向治疗在OSCC的临床应用方面表现出巨大潜力[4]。

细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基(cyclin-dependent kinase regulatory subunit, CKS)2是一种编码CKS2蛋白的基因，该基因是CKS的结合配偶体，参与调节细胞周期的进展[5]。现有的研究表明，CKS2的异常表达参与多种恶性肿瘤的发生发展，例如卵巢癌[6]、乳腺癌[7]、肺癌[8]及胃癌[9]等。在肝细胞癌中，CKS2通过降低磷酸酶张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, PTEN)的活性促进癌细胞的生长[10]。在结肠癌中，CKS2通过激活人封闭蛋白1(claudin 1)的表达促进癌细胞的增殖[11]。此外，CKS2对p53的活动进行负调节，从而增强癌细胞的细胞周期进展[12]。已有的研究表明，CKS2在多种肿瘤中异常表达且在细胞周期调控中发挥重要作用，与肿瘤细胞的增殖、凋亡和DNA损伤修复等关键过程密切相关。因此，CKS2可能是一个具有重要生物学作用的指标，其异常表达可能对肿瘤的发展和治疗反应产生重要影响。

1、资料与方法

1.1 临床资料

选取2012年1月至2015年12月于南京医科大学附属淮安第一医院口腔颌面外科行“口咽部恶性肿物扩大切除术”的91例OSCC患者，其病灶分布于舌、颊、牙龈、腭及唇部，术后病理均证实为OSCC。其纳入标准如下：1)患者术前未行放化疗；2)患者的基本信息完善。在同一时间段，通过口腔外科手术获得20份健康口腔黏膜标本作为对照。患者术后每3个月电话随访1次，随访至2022年12月，记录每个患者的存活情况、肿瘤复发情况及生存时间。本研究经淮安市第一人民医院伦理委员会审核批准(伦理号：KY-2023-055-01),患者知情并签署相关文件。

1.2 主要材料与试剂

人OSCC细胞系Cal27细胞(北京中源生物),DMEM/F12培养基、胰蛋白酶(Gibco, 美国),CKS2抗体(Abcam, 英国),化学发光试剂盒(Bio-Rad, 美国),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体(CST,美国),二抗(北京中杉金桥),DAB染色液(福州迈新),即用型羊抗血清(bovine serum albumin, BSA)(北京博士德),Lipofectamine 3000(Thermo, 美国),细胞周期检测试剂盒(BD Bioscience, 美国)。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析

通过访问基因表达数据库(gene expression omnibus, GEO)获取OSCC的相关GSE数据集(GSE9844X、GSE13601、GSE25093、GSE25099、GSE30784、GSE37991)。下载原始芯片数据文件并使用生物医学数据分析盒子(SangerBox)对数据进行解析从而获取样本信息及基因表达值，使用R程序对数据进行信号均一化和对数转换，将获取的OSCC及正常组织中的CKS2 mRNA表达水平数据进行统计学比较。

1.3.2 免疫组化染色及评分

将OSCC患者及健康者口腔黏膜样本切片进行融蜡、水化、抗原修复、3%H2O2及BSA封闭，CKS2一抗过夜；二抗室温孵育后DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯封片。切片的阳性强度由淮安市第一人民医院病理科医师进行双盲评价。阳性强度=染色深度(0/1/2/3)×染色面积(1/2/3/4),范围在0～12分，≤4为低表达，>4为高表达，具体免疫组化(immunohistochemistry, IHC)染色及评分过程参考我们之前的研究[13]。

1.3.3 Cal27细胞培养及siRNA转染

Cal27细胞置于37 ℃、5% CO2的孵育箱，培养基为加入10%胎牛血清的DMEM/F12。转染siRNA时，Cal27细胞经胰蛋白酶消化后计数，以2×104个/孔接种于6孔板中；24 h后用Lipofectamine 3000进行siRNA的转染，siControl作为对照组，均转染48 h。siCKS2-1序列：5′-GCUGGGUUCAUUACAUGAU-dTdT-3′;siCKS2-2序列：5′-CAGAACCACAUAUUCUUCUdTdT-3′;siControl序列：5′-GATCGTACAGGCGCTTAGCTA-3′,均由南京普诺恩生物技术公司设计并合成。

1.3.4 Western blot

收集转染48 h的siControl及siCKS2细胞，提取细胞蛋白并行BCA蛋白浓度检测。电泳分离蛋白，转膜后封闭CKS2抗体(1∶1 000)及GAPDH抗体(1∶2 000)过夜，对应二抗孵育。成像数据使用Image J进行灰度定量分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白半定量结果。

1.3.5 细胞克隆形成实验

将转染48 h的siCKS2细胞及siControl细胞用0.25%胰蛋白酶消化及计数，以每孔1×103个细胞/孔接种于小皿中，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培养10 d; 当培养皿中出现克隆时终止培养，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定15～30 min, 结晶紫染10～30 min, PBS洗涤后晾干扫描仪拍照，正置显微镜下计数。

1.3.6 划痕实验

待6孔板中siCKS2细胞及siControl细胞长满后，用无菌20 μL移液管尖端在各孔板内划出一创口。PBS洗涤，无血清DMEM/F12培养液培育。显微镜记录0、24 h的创口情况，使用Image J软件计算伤口愈合百分比。

1.3.7 细胞周期实验

获取转染48 h的siCKS2细胞及siControl细胞，-20 ℃条件下放在70%乙醇中固定过夜；将细胞与含有50 μg/mL碘化丙锭(propidium iodide, PI)和100 μg/mL 核糖核酸酶(ribonuclease A,RNase A)的PBS在37 ℃下孵育30 min; 使用流式细胞仪对细胞进行PI强度分析。

1.4 统计学分析

所有统计分析均使用SPSS 21.0和Excel软件进行，绘图则使用GraphPad Prism 8及R程序进行。通过卡方或Fisher精确概率法比较CKS2表达水平与患者临床参数之间的相关性；Kaplan-Meier生存曲线用来计算患者的总体及无病生存率，通过Log-rank法比较其差异；通过t检验和方差分析进行定量数据的统计分析。在所有的分析中，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结 果

2.1 正常口腔黏膜及OSCC组织中CKS2的表达情况

通过分析GEO中的OSCC队列数据发现，CKS2 mRNA表达水平在OSCC样本中高于正常口腔黏膜样本(P<0.01,图1)。IHC染色结果(图2)显示：CKS2蛋白在正常黏膜组织中几乎看不到阳性染色，而在OSCC组织中主要集中在细胞核内。对正常口腔黏膜及OSCC的IHC结果进行阳性强度评价并进行统计学分析，结果显示在OSCC组织中CKS2呈高表达，差异有统计学意义(P<0.01,表1)。

图1 6个OSCC队列中CKS2 mRNA表达水平在正常口腔黏膜上皮及OSCC组织中的表达   

2.2 CKS2蛋白在OSCC中的临床病理意义

为探究CKS2在OSCC中的临床应用价值，将CKS2表达水平以阳性强度4分为临界值，分为CKS2低表达组及CKS2高表达组，结果显示CKS2高表达与患者的肿瘤大小和颈淋巴结转移有显著相关性(P<0.05,表2)。

图2 CKS2在正常口腔黏膜上皮及OSCC组织中的表达   

表1 CKS2在正常口腔黏膜和OSCC组织中的表达

表2 OSCC组织中CKS2表达与患者临床参数之间的关系

结合患者的预后随访资料，91例患者中死亡患者有31例，3例患者出现复发和转移。对CKS2低表达和高表达两组患者总体及无病生存率进行比较，Kaplan-Meier生存分析结果显示：与CKS2低表达组比较，CKS2高表达组患者总体生存率和无病生存率较低(P<0.05,图3),提示CKS2高表达组患者预后更差。

2.3 CKS2沉默后抑制Cal27细胞增殖和迁移并诱导G2期阻滞

图3 CKS2的表达与OSCC患者总体生存率和无病生存率的关系   

Western blot结果显示(图4A):转染48 h后，siCKS2组CKS2蛋白表达量较siControl组明显下降，提示siRNA敲低有效。

克隆形成实验结果表明(图4B):siControl组细胞克隆的颜色较siCKS2组更深；对细胞克隆进行计数，siControl组克隆形成的数量为(214.7±6.9)个，明显多于siCKS2-1组(116.3±5.3)个和siCKS2-2组(44.7±13.8)个(P<0.01),提示CKS2敲减后Cal27细胞增殖能力降低。

划痕实验结果显示：siControl组划痕24 h后，创口宽度明显小于siCKS2-1组和siCKS2-2组(图4C)。半定量分析结果显示，siControl组伤口愈合百分比为(81.9±3.0)%,多于siCKS2-1组(49.4±4.5)%和siCKS2-2组(51.8±4.2)%(P<0.01),提示CKS2沉默后Cal27细胞迁移能力降低。

细胞周期实验(图4D)结果表明，转染48 h后，siControl组G1期细胞比例为(53.5±1.3)%,siCKS2-1组G1期细胞比例为(46.7±1.7),siCKS2-1组G1期细胞比例为(35.1±1.6)%;G2期细胞比例则由siControl组的(5.1±0.5)%增加至siCKS2-1组的(18.5±1.8)%及siCKS2-2组的(27.6±0.9)%(P<0.01),提示CKS2沉默后诱导Cal27细胞G2期阻滞。这些实验结果表明CKS2可能参与OSCC发生发展中细胞周期的调控。

3、讨 论

作为CKS之一，CKS2在哺乳动物的早期胚胎发育，减数分裂，体细胞分裂过程中发挥重要作用[14]。作为细胞依赖性激酶1(cyclin-dependent kinases 1,CDK1)的调节亚基，CKS2能够与细胞周期调控的相关蛋白相互作用形成复合物，参与恶性肿瘤细胞周期调控、细胞凋亡、肿瘤侵袭及转移等多个生物学过程[14,15]。

研究表明，CKS2高表达与恶性肿瘤患者较差的预后相关。例如，CKS2的高表达与上皮性卵巢癌患者的国际妇产科协会(federation international of gynecology and obstetrics, FIGO)分期、组织学分级及较低的总生存率有关[6]。CKS2的上调与肺腺癌患者较差的生存率和较大的肿瘤体积相关[16]。有研究表明，高CKS2表达与舌鳞癌的总生存率降低相关[17]。目前，基因表达分析在生物信息学领域扮演着重要的角色，可以帮助我们理解基因的功能、调控机制以及与疾病相关的变化。通过生物信息学分析，我们对多个已公开的OSCC芯片数据集进行基因表达谱分析，结果同样表明CKS2基因在OSCC中高表达，结合本研究队列中CKS2蛋白高表达这一结果，有力地证明了CKS2在OSCC中扮演着致癌基因的角色。对OSCC组织样本进行IHC染色及统计分析，发现CKS2高表达与患者肿瘤大小及颈淋巴结转移高度相关。此外，生存分析结果显示，CKS2高表达组总体及无病生存率低，提示CKS2对OSCC患者预后的评估有一定的参考价值。

CKS2已被表征为一种癌蛋白，并被认为是多种实体瘤的潜在治疗靶点。CKS2在一些实体肿瘤中直接诱导细胞周期蛋白A(cyclin A,CCNA)和细胞周期蛋白B(cyclin B,CCNB)的上调，从而促进癌细胞增殖。CKS2和CDK之间的结合使得肿瘤细胞能够覆盖S期检查点，并在应激条件下产生增殖优势[18]。除了已知的CDK结合能力外， 最近的一项研究发现，CKS2与单链DNA结合蛋白1(single-stranded DNA binding protein 1,SSBP1)形成复合物，导致线粒体DNA复制活性增强[19]。本研究与之前的研究一致[20],CKS2沉默后抑制Cal27细胞的增殖，诱导细胞G2期阻滞。这些发现表明CKS2可能是G2/M相变的重要调节剂，通过干扰CKS2与细胞周期蛋白的结合或可抑制OSCC的发生发展。此外，本实验研究结果表明，CKS2沉默后OSCC细胞迁移能力下降。有研究表明，CKS2通过激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和丝裂原活化蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase p38,MAPK p38)等不同的信号系统，诱导上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),在卵巢癌、结直肠癌及脑胶质瘤中促进癌细胞的迁移和侵袭[6,21,22]。由于目前大量研究证实CKS2与EMT相关，结合CKS2沉默后Cal27细胞迁移能力降低，我们大胆推测CKS2在OSCC中通过调节EMT来抑制OSCC的迁移能力。这也就部分解释了CKS2高表达与颈淋巴转移相关的原因。然而，具体的机制尚不明确，进一步的研究有助于揭示CKS2在细胞迁移和转移中的具体机制，并为开发针对CKS2的抗癌治疗策略提供理论基础。

图4 CKS2沉默对Cal27细胞增殖、周期和迁移的影响  

综上所述，CKS2在OSCC组织中呈高表达，且CKS2的高表达与OSCC患者肿瘤大小、颈部淋巴结转移及不良预后高度相关；CKS2沉默能抑制Cal27细胞的增殖及迁移能力并诱导G2期阻滞。因此，CKS2可能是OSCC患者诊断和治疗的一个新的生物学标志物及潜在的治疗靶点。

基金资助:南京医科大学科技发展基金(NMUB20220213,NMUB-20220206);

文章来源:冯星雨,张伟,赵雅.CKS2在口腔鳞状细胞癌中的表达及其细胞生物学意义[J].口腔生物医学,2023,14(04):233-238.