2020年全球卵巢癌占所有恶性肿瘤新发病例的3.4%，占所有死亡病例的4.7%，卵巢癌的发病率和死亡率居全球女性恶性肿瘤的第8位[1]。我国流行病学调查显示从2005-2016年我国卵巢癌发病率和死亡率快速升高（平均年度变化百分比分别为7.25%、6.06%），发病率和死亡率分别居我国女性恶性肿瘤的第9位和第11位[2]。卵巢癌发病隐匿，早期多无特异性临床症状，大多数患者就诊时已为晚期，我国卵巢癌的5年生存率不足45%[3]，如何改善卵巢癌患者的生存状况是临床治疗的世纪难题。随着分子生物学研究的不断深入，人们发现基因组的非编码部分与各种生理活动和病理活动均相关，研究显示长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA）可以通过调控蛋白编码基因的表达来调节细胞的生物学行为[4]。肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(Actinfilament-associated protein1-antisense RNA1,AFAP1-AS1）定位于4号染色体，是近年来新发现的一种lncRNA，是AFAP1蛋白编码基因的反义RNA。AFAP1是一种衔接蛋白，是影响肌动蛋白结构完整性的重要蛋白，可以影响细胞的转移、运动和侵袭等生物学行为[5-6]。AFAP1还是构成细胞张力丝的组成蛋白，磷酸化后的AFAP1可以激活SRC基因家族，SRC家族是目前研究最多的与人类恶性肿瘤相关的基因家族。目前已有研究表明AFAP-AS1异常表达与消化道肿瘤之间有密切联系[7]，但还鲜有关于其与卵巢癌之间的研究报道。本研究拟观察AFAP1在卵巢癌中的表达并通过细胞实验探究其对卵巢癌细胞生物学行为的影响，以期为卵巢癌的临床治疗寻找新靶点。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1一般资料

收集于2019年1月～2023年1月期间在我院进行卵巢癌根治术手术切除的73例患者的组织标本及患者的一般资料；患者年龄42～76(60.44±3.17）岁；FIGO分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期20例、Ⅲ期30例、Ⅳ期14例；分化程度：低分化26例、中分化15例、高分化32例。所有患者术后立即将切除的癌组织和癌旁组织保存于液氮中，随后保存于-80℃冰箱中。

纳入标准：(1)临床资料完成；(2)符合卵巢癌诊断标准[8]，经病理确诊；(3)术前未进行过放化疗治疗；(4)签署知情同意书。

排除标准：(1)合并其它恶性肿瘤；(2)合并自身免疫性疾病；(3)合并严重的感染性疾病。

1.1.2细胞

细胞株选用A2780卵巢癌细胞株（中山大学肿瘤防治中心提供）。

1.1.3主要试剂与仪器

RPMI 1640培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）、胰蛋白酶（Hy-Clone），转染试剂盒（Thermo）、反转录试剂盒，噻唑蓝（Methyl thiazol tetrazolium,MTT）试剂盒、荧光实时定量PCR(qRT-PCR）试剂盒、总RNA提取试剂、Lipofectamine 2000、Matrigel基质胶、AFAP1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin单克隆抗体、二抗（Abcam）、辣根过氧化物酶（北京中杉金桥公司）；CO2培养箱（常州恒隆仪器有限公司）、酶标仪（Thermo）、生物安全柜（BSC-1100IIA2-X，济南欧莱博）、凝胶电泳成像分析系统（美国Alpha）实时荧光定量PCR仪（美国ABI），等。

1.2方法

1.2.1 RT-PCR检测卵巢癌组织和癌旁组织中AFAP1-AS1和AFAP1 mRNA的表达

Trizol法提取组中的总RNA，检测RNA浓度和纯度，根据说明书反转录合成cDNA，然后进行RT-PCR，引物设计见表1，反应条件为：95℃2 min;95℃30 s、55℃30 s、72℃40 s、72℃终延伸3 min，共40个循环。采用2-ΔΔCt衡量目的基因的相对表达。

1.2.2 Western blot检测组织中AFAP1蛋白的表达

采用Tris法提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，配置10%SDS-PAGE凝胶，上样20µL,120V垂直电泳60 min，转膜，加入5%脱脂牛奶室温封闭60 min，加入稀释后的一抗GAPDH、AFAP1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin,4℃过夜孵育，洗膜3次，加入标记的二抗，室温孵育60 min，显影，曝光，采用Image J软件计算每个条带的光密度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表达水平。

表1本文引物序列

1.2.3细胞转染

先以AFAP1-AS1为靶点设计小干扰RNA(siRNA),siRNA的干涉序列为5'-GGGCTTCAATTTACAAGCATT-3'，阴性对照siRNA(si-NC）的序列为：5'-CCTATCTGGTCAACACG-TATT-3'。所有A2780卵巢癌细胞复苏后，待细胞生长到对数期进行转染。分为对照组（不转染）、si-NC组（转染si-NC）、siRNA组（转染siRNA），分别取1×106个细胞接种于6孔板中，设置6个平行样，加入2 mL完全培养基，待细胞融合达到80%时根据脂质体说明书进行转染，分别将siRNA和si-NC转染至A2780卵巢癌细胞中，转染后继续培养24 h。RT-PCR检测各组细胞EMT相关mRNA的表达，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin引物序列详见表1，检测方法同前。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖

分别将未转染、转染si-NC、转染siRNA组的细胞接种于96孔板中，每孔接种2×106个细胞，分别于接种24 h、48 h、72 h后向每孔中加入20µL浓度为1.5 g/L的MTT溶液，然后37℃、5%CO2继续培养，4 h后弃去上清液，加入150µL DMSO,450 nm检测，每个时间点分别设置6个复孔。

1.2.5 Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移

侵袭实验：开始实验前，提前12 h将基质胶取出并，基质胶和不含胎牛血清的培养基按照1∶4的比例进行充分混合，然后铺在小室中。各组细胞在常规培养24 h后重悬，加入不含胎牛血清的培养基进行12 h饥饿培养，调整细胞浓度为1×106个/mL，然后进行消化、重悬，接种于上室。往下室加入含有10%胎牛血清的培养基，37℃、5%CO2条件下培养48 h，取出小室，弃去培养液，PBS缓冲液冲洗3遍，轻轻擦除未迁移的细胞，多聚甲醛固定、风干，使用1%结晶紫染色30 min,PBS缓冲液冲洗3遍，光学显微镜下观察，每个样本随机选择5个视野进行观察并进行细胞计数，以平均值为最终结果。迁移实验：不铺设基质胶，其余操作于侵袭实验相同。

1.2.6划痕实验

各组细胞转染后继续培养24 h，接种于六孔板中，待细胞融合至90%时，使用灭菌枪头垂直于细胞孔划线，弃去培养基，PBS缓冲液冲洗3遍，更换加有10%胎牛血清的RMPI1640培养基，37℃、5%CO2重新培养，培养24 h后弃去培养基，PBS缓冲液冲洗3遍，晾干，0.1%结晶紫染色30 min,PBS缓冲液冲洗3遍，显微镜下观察细胞横向迁移情况，使用Image J软件计算细胞迁移面积，并计算细胞迁移率，细胞迁移率=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.2.7 Western blot检测蛋白的表达

各组细胞培养48 h后收集细胞，加入RIPA裂解液，采用前述方法进行检测。

1.2.8 F-actin染色检测细胞骨架排列

各组细胞取对数生长期细胞进行常规培养后，使用胰蛋白酶进行消化后制成单细胞悬液，置于24孔培养板内进行培养（培养板内预先放置多聚赖氨酸处理过的无菌圆形爬片），37℃、5%CO2常规培养，待细胞融合至70%～80%时，根据试剂盒说明书进行染色操作，具体如下：4%多聚甲醛固定细胞30 min，使用PBS缓冲液清洗3次，然后加入0.2%的tritonX-100溶液进行透化处理，PBS缓冲液清洗3次，加入200µL罗丹明标记后的鬼笔环肽工作液，避光孵育60 min,PBS缓冲液清洗3次，再加入200µL DAPI溶液，避光孵育10 min,PBS缓冲液清洗3次，加入抗荧光淬灭剂，封片，避光保存，使用正置荧光显微镜进行观察，每组随机选取10个视野进行观察并拍照。

1.3统计学分析

所有数据使用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料采用均值±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05时认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1卵巢癌组织和癌旁组织中AFAP1-AS1和AFAP1的表达

卵巢癌组织和癌旁组织AFAP1-AS1的相对表达分别为2.24±0.47、1.46±0.31，差异有统计学意义（t=11.837,P<0.01）。卵巢癌组织和癌旁组织AFAP1 mRNA的相对表达分别为2.67±0.59、1.75±0.42，差异有统计学意义（t=10.854,P<0.01);AFAP1蛋白的相对表达分别为2.89±0.56、1.05±0.22，差异有统计学意义（t=24.374,P<0.01）。

2.2 A2780卵巢癌细胞增殖情况

3组在0 h和24 h吸光度值差异无统计学意义（P>0.05）。在48 h和72 h吸光度值差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组比较，siRNA组吸光度值显著低于对照组和si-NC组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2、图1）。

2.3迁移侵袭实验

siRNA组迁移细胞个数、侵袭细胞个数和48h迁移率均显著低于对照组（P<0.05）（表3、图2）。

表2 MTT法检测3组细胞不同培养时间吸光度值比较

图1各组细胞增殖曲线

表3 3组细胞迁移数量和侵袭数量比较

2.4 AFAP1-AS1及其相关mRNA的表达

si-RNA组AFAP1-AS1及AFAP1、N-cadherin、Vimentin mRNA表达显著降低，E-cadherin mRNA表达显著升高（P<0.05）（表4）。

2.5 AFAP1及其相关蛋白的表达

si-RNA组AFAP1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低，E-cadherin蛋白表达显著升高（P<0.05）（表5、图3）。

图2 3组细胞的侵袭和迁移情况

A1～A3.Transwell侵袭实验（×200),A1.对照组；A2.si-NC组；A3.siRNA组。B1～B3.Transwell迁移实验（×200);B1.对照组；B2.si-NC组；B3.siRNA组。C.划痕实验，标尺=100µm

表4 RT-PCR检测3组AFAP1-AS1及EMT mRNA的表达

2.6 F-actin染色检测细胞骨架排列

对照组和si-NC组细胞排列良好规则，在细胞边缘均可观察到大量的丝状伪足和大量肌动蛋白聚合；si-RNA组细胞排列紊乱，丝状伪足和激动蛋白聚合明显减少，边缘呈现破损状（图4）。

3、讨论

目前，癌症是全球主要的死亡原因之一，卵巢癌是女性生殖系统排名第三的恶性肿瘤，可发生于任何年龄段，但常见于50岁以上年龄段人群。患者常以非特异性的盆腔或腹部症状就诊，多数患者在确诊后可以选择的治疗手段非常有限，全世界范围内死于卵巢癌的患者每年超过14万例。随着我国人民的平均寿命延长，我国2019年肿瘤登记年报数据显示近十年来卵巢癌发病率和死亡率均快速上升[9]。目前，尽管临床已经开发了放化疗、靶向治疗、免疫治疗等多项技术，但卵巢癌患者的五年生存率仍然不容乐观（不足45%），绝大部分确诊时已为晚期，晚期卵巢癌患者的生存率不足30%，高转移性和高侵袭性是导致卵巢癌患者死亡的主要原因[10]。寻找更精确的诊断生物标志物和有效的治疗靶点是对抗卵巢癌的关键。

表5 Western blot检测EMT蛋白表达

图3 3组AFAP1、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表达（Western blot检测）

图4 3组细胞骨架排列的变化（F-actin抗体免疫荧光染色）

随着分子生物学研究的深入，人类基因组计划发现lncRNAs在生物的进化过程中有重要作用，更多的证据表明：基因组的非编码部分在正常生理学和疾病中都具有至关重要的功能性。lncRNAs通过调节基因的转录、翻译、修饰来调控生长、发育、免疫和生殖等众多生理过程，在生命体中承担信号、诱导、诱饵和支架等多种功能角色，是目前生物医学领域的研究热点。此外，近年来研究发现lncRNAs的表达与恶性肿瘤之间存在千丝万缕的联系。AFAP1-AS1是一种反义lncRNAs，其结构上的的第2外显子与AFAP1基因结构上的第14～16外显子区域可以发生互补和重叠。AFAP1-AS1可以通过调控其互补链上的基因表达来发挥生物学功能，被认为是一种致癌基因[11]。但目前关于其与卵巢癌之间的研究较少，其在卵巢癌中的生物学功能目前尚不清楚，其具体的分子机制也难以捉摸。本文观察到卵巢癌组织中AFAP1-AS1 mRNA的表达显著高于癌旁组织。AFAP1-AS1在多种实体瘤中高度表达，目前已有相关研究发现在非小细胞肺癌患者的癌组织标本中检测到AFAP1-AS1 mRNA表达显著上调，且伴有淋巴结转移的患者AFAP1-AS1 mRNA表达显著高于无转移者[12]。Zhong等[13]通过原位杂交方法检测了187例石蜡包埋的肺癌和36例正常肺上皮组织中AFAP1-AS1的表达，发现AFAP1-AS1在肺癌中高表达，且与患者的不良预后正相关。龚智勇等[14]报道AFAP1-AS1 mRNA在子宫内膜癌患者癌组织中表达显著升高，与本文研究结果具有相似性。

AFAP1-AS1不仅与肿瘤的发生有关，还与肿瘤的进展密切相关。AFAP1-AS1可以通过与其他蛋白发生直接或间接的结合，并可以吸附和竞争调节其它微小RNA的表达，进而调节下游基因和蛋白的表达，发挥促进细胞增殖、抗凋亡、侵袭转移和促进耐药性作用。为了进一步确定AFAP1-AS1对卵巢癌生物学行为的影响，本文进一步展开体外细胞实验，结果发现，在对AFAP1-AS1进行干扰后，AFAP1-AS1mRNA表达显著下调，同时卵巢癌细胞的增殖活性、横向迁移能力、纵向迁移能力、侵袭能力均显著下降，提示抑制AFAP1-AS1mRNA表达可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，AFAP1-AS1可能是抑制卵巢癌细胞增殖的潜在靶点，这是令人惊喜的结果。虽然目前关于卵巢癌的相关研究较少，但已经有学者对其他恶性肿瘤细胞进行体外研究，观察抑制AFAP1-AS1mRNA对肿瘤细胞的影响。Li等[15]通过双荧光素酶测定证实了AFAP1-AS1可以靶向miR-195-5p促进结肠癌增殖和转移；Gui等[16]AFAP1-AS1在膀胱癌组织中高表达，且下调AFAP1-AS1后，膀胱癌细胞的增殖能力以及侵袭能力减弱，且这种减弱作用在过表达AFAP1后得到了逆转。

为了进一步验证AFAP1-AS1对卵巢癌的迁移和侵袭的促进作用，本研究采用RT-PCR和western blot法分别检测了上皮-间充质转化标志物mRNA和蛋白质的表达的变化，并采用F-actin染色观察了细胞骨架排列的变化。结果发现抑制AFAP1-AS1表达后，AFAP1-AS1、N-cadherin、Vimentin mRNA表达显著降低，AFAP1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低，E-cadherin mRNA和蛋白表达则显著上升，提示抑制AFAP1-AS1表达可以影响EMT信号通路上相关蛋白的表达，AFAP1-AS1可能与EMT信号通路之间存在关联。N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白是EMT通路上的重要蛋白，其表达是影响肿瘤细胞迁移和侵袭能力的关键。上皮-间充质转化是癌症发生和进展中的常见步骤，也是癌细胞发生侵袭和转移的关键步骤，其典型特征是上皮特征消退、间充质特性增强、细胞流动性增加。细胞间的黏附作用减轻和细胞骨架被重塑是细胞发生迁移的基础，E-cadherin缺失或下调会促进上皮-间充质转化；N-cadherin的上调则会破坏细胞间连接，减轻细胞的相互黏附作用，增加细胞的侵袭能力[17]。细胞运动和转移离不开完整的细胞骨架结构，Vimentin是骨架蛋白的主要成分，AFAP1能够调整肌动蛋白的完整性，影响细胞运动、肿瘤侵袭和转移，破坏细胞骨架的排列是抑制细胞转移的重要手段。

本研究中抑制AFAP1-AS1表达后，Vimentin蛋白表达显著下调，丝状伪足和激动蛋白聚合明显减少，边缘呈现破损状，细胞动力减少，转移和侵袭能力下降。目前已有不少学者在其它肿瘤细胞中发现干扰AFAP1-AS1能影响细胞的EMT,Zhang等[18]报道AFAP1-AS1上调可以激活Wnt/β-catenin通路，通过增加三阴乳腺癌中C-myc和上皮-间质转化相关分子的表达，促进肿瘤发生和细胞侵袭。敲除AFAP1-AS1则可以明显降低上皮间质化，抑制细胞的侵袭[19]。Abdul等[20]报道AFAP1-AS1可以与致癌基因CRKL发生双向作用，通过靶向CRKL介导的肝癌进展，基因敲除AFAP1-AS1可以抑制肝癌细胞迁移和侵袭特性以及上皮-间质转化过程。潘一平等[21]在肺癌A549细胞中观察到类似的现象：干扰AFAP1-AS1表达后，E-cadherin基因转录和蛋白表达发生上调，造成细胞迁移能力减弱。范慧洁等[22]也在甲状腺乳头状癌细胞中发现敲低AFAP1-AS1后，vimentin mRNA和蛋白表达显著降低，而E-cadherin的mRNA和蛋白表达显著增加。但是关于AFAP1影响EMT信号通路上蛋白表达的具体机理还需要进一步进行研究。

本研究的局限性，本研究仅对卵巢癌患者的癌组织和癌旁组织中的AFAP1-AS1的表达，未检测健康人群卵巢组织的表达。本研究观察到了抑制AFAP1-AS1对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响，并通过检测EMT相关mRNA、蛋白质的表达和细胞骨架的变化初步探究了其机理，但未研究AFAP1-AS1过表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响，同时还需要进一步展开体内实验进行深入研究。

综上所述，AFAP1-AS1高表达于卵巢癌中，抑制AFAP1-AS1的表达可能抑制卵巢癌细胞上皮-间充质转化相关蛋白的表达，从而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。

作者贡献声明江飞云负责科研设计、数据分析整理以及文章撰写、修改和审阅；丁叶屏、蔡文负责统计及文章审阅；刘星宇、吴明彩负责实验实施、数据收集及协助文章审阅

利益冲突声明所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突，课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道

机构伦理问题研究方案经华东师范大学附属芜湖医院医学伦理委员会批准

参考文献:

[2]黄海涛,陈姝玉,耿旭,等. 2005-2016年中国女性卵巢癌发病及死亡趋势研究[J].中国全科医学,2022, 25(8):990-994.

[3]陈忠绍,王元见,张溪,等.单中心卵巢癌患者5年生存率随访报告[J].现代妇产科进展,2023, 32(1):14-17.

[4]刘毅,倪荣.LncRNA RSU1P2和miRNA-95在卵巢癌患者组织中的表达及其临床意义[J].解剖学研究,2022, 44(3):235-239.

[7]李志明,龙凤,何建新,等.长链非编码RNAAFAP1-AS1在癌症中作用及其机制的研究进展[J].中国癌症杂志,2021, 31(4):350-361.

[8]李宁,吴令英.中国临床肿瘤学会《卵巢癌诊疗指南(2021年版)》更新要点[J].中国实用妇科与产科杂志,2021, 37(7):720-723.

[9]郝捷,魏文强,张思维,等. 2019年中国肿瘤登记年报[M].北京:人民卫生出版社,2021:170-173.

文章来源:江飞云,丁叶屏,刘星宇,等.AFAP1-AS1在卵巢癌组织中的表达水平及其对卵巢癌生物学行为的影响[J].解剖学研究,2025,47(01):43-50.